背景介紹：

細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡間平衡的維持對多種細(xì)胞有機(jī)的發(fā)育與生命的維持至關(guān)重要，其失衡將導(dǎo)致各 種疾病的發(fā)生.如：人類平均每天有 6×10（10）個(gè)新細(xì)胞生成，同時(shí)又接近同等數(shù)量的成熟細(xì)胞被機(jī)體清除.在細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡間存在一種配對關(guān)系，因此區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞對研究生長條件的控制和 細(xì)胞死亡過程都是十分重要的。

工作原理：

活/死細(xì)胞雙染色試劑盒（綠/紅），提供了一種方便的測定方法，以評(píng)估細(xì)胞的活力，它基于使用兩種探針同時(shí)測定活細(xì)胞和死細(xì)胞的方法，這些探針測量*的細(xì)胞健康參數(shù)：質(zhì)膜完整性和細(xì)胞內(nèi)酯酶活性。該試劑盒利用可滲透細(xì)胞的綠色熒光染料 LiveDye（Ex / Em = 488/530 nm）染色活細(xì)胞，并使用不可滲透細(xì)胞的紅色熒光染料 NucleiDye（Ex / Em = 535/617）用來染死細(xì)胞。

活/死細(xì)胞雙染色試劑盒#AMJ-KT0005：

類型 細(xì)胞分析

檢測方法 熒光顯微鏡，流式細(xì)胞術(shù)；

活細(xì)胞綠色熒光染料 LiveDye（Ex / Em = 488/530 nm）死細(xì)胞紅色熒光染料 NucleiDye（Ex / Em = 535/617）

運(yùn)輸 冰袋運(yùn)輸

保存 請參閱說明書中各個(gè)組分的存儲(chǔ)條件。

自發(fā)貨之日起，在推薦溫度下至少穩(wěn)定 12 個(gè)月。

其它 默認(rèn)使用 24 孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)

* 注意事項(xiàng)

1）為了安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

2）NucleiDye 是一個(gè)潛在的誘變因子，使用本試劑時(shí)應(yīng)采取適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)措施

3）LiveDye 需要在干燥低溫避光條件下儲(chǔ)存，儲(chǔ)存溫度為-20℃。

需用戶自行準(zhǔn)備：

離心機(jī)

移液器及吸頭

熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀

24 孔板（細(xì)胞培養(yǎng)用）

磷酸鹽緩沖液 (PBS)

活/死細(xì)胞雙染色試劑盒（綠/紅）特點(diǎn)：

1.針對哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色進(jìn)行優(yōu)化

2.可用于使用流式細(xì)胞術(shù)或熒光顯微鏡，快速定量細(xì)胞活力

使用方法：

*[Note] 本實(shí)驗(yàn)中選擇的細(xì)胞為 HeLa 細(xì)胞。由于不同類型細(xì)胞的*染色條件不同，LiveDye和 NucleiDye 的*染色濃度會(huì)有所不同。

一．試劑準(zhǔn)備：

A.活細(xì)胞-綠色染料（LiveDye）：冰上避光放置。

B.死細(xì)胞-紅色染料（NucleiDye）：冰上避光放置。

C.實(shí)驗(yàn)緩沖液 (10×) [Assay Buffer(10×)]：用 ddH20 稀釋 10x 實(shí)驗(yàn)緩沖液，至 1x 實(shí)驗(yàn)緩沖液（工作液）。使用前預(yù)熱到 37C。

D.染色工作液：每 1 ml 的實(shí)驗(yàn)緩沖液（1X）中，加入 1ul 活細(xì)胞-綠色染料（LiveDye）和 1ul 死細(xì)胞-紅色染料（NucleiDye），混合均勻（適用于2個(gè)樣品孔，每孔0.5ml）。如有大量樣品，請成比例的擴(kuò)大染色工作液配置。

二．

（一）熒光顯微鏡：

1.用預(yù)期的方法處理細(xì)胞，在不含誘導(dǎo)劑條件下孵育細(xì)胞建立陰性對照組；

2.對于貼壁細(xì)胞，在 24 孔板的蓋玻片上種植和培育細(xì)胞，在 CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中 37°C 培養(yǎng)至少 24 小時(shí)。先用細(xì)胞刮刀或者胰酶-EDTA 消化細(xì)胞，之后離心收集細(xì)胞（1000 rpm，3 min）。

對于懸浮細(xì)胞，直接離心(4℃, 300g, 5 min）收集細(xì)胞。

3.用 PBS 洗滌細(xì)胞兩次，移除液體。

4.在 24 孔板中，每個(gè)孔加入 0.5ml 染色工作液來，37℃避光孵育 15-30 min。

5.用 PBS 洗滌細(xì)胞兩次。

6.將蓋玻片覆蓋到載玻片上，盡快使用適當(dāng)?shù)臑V光片通過熒光顯微鏡分析細(xì)胞。

*[Note] ：為了獲得*效果，可以使用抗熒光淬滅劑對其進(jìn)行觀察。

（二）流式細(xì)胞分析：

1.用預(yù)期的方法處理細(xì)胞。

*[Note] ：對于所有的處理和未處理的細(xì)胞樣本，建議把未染色的對照組細(xì)胞懸浮在實(shí)驗(yàn)緩沖液（不含有 LiveDye 和 NucleiDye），用于流式細(xì)胞分析；

2.對于非貼壁細(xì)胞，收集 1-5 ×105 個(gè)細(xì)胞離心 (4℃, 300g, 5 min)，用預(yù)冷的 PBS 洗滌

2 次，棄去 PBS。對于貼壁細(xì)胞，先用胰蛋白酶（不含 EDTA）消化細(xì)胞，然后離心去上清。

3.用 500ul 染色工作液來懸浮細(xì)胞。

4.避光孵育 15-30 min。

5.使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行相應(yīng)檢測與分析。

相關(guān)研究工具：

貨號(hào) 名稱 規(guī)格

AMJ-AB1001 β-actin 單克隆抗體(AJ01) 30ul, 100ul, 1ml

AMJ-AB1002 GAPDH 單克隆抗體(1B4) 30ul, 100ul, 1ml

AMJ-AB1003 β-Tubulin 單克隆抗體(2B5) 30ul, 100ul, 1ml

AMJ-AB1004 植物Actin 單克隆抗體(2G2) 30ul, 100ul, 1ml

AMJ-AB1005 Flag 標(biāo)簽單克隆抗體(2B9) 30ul, 100ul, 1ml

AMJ-AB1006 HA 標(biāo)簽單克隆抗體(3F5) 30ul, 100ul, 1ml

AMJ-AB1007 His 標(biāo)簽單克隆抗體(4C2) 30ul, 100ul, 1ml

AMJ-CH0001 預(yù)染蛋白分子量 Marker（10-180 kDa） 100ul, 250ul, 250ul*10

AMJ-CH0002 蛋白酶抑制劑套裝（100X） 1ml, 1ml*2, 1ml*5

AMJ-KT0002 WB 超敏ECL 底物試劑盒 50ml, 200ml, 1L

AMJ-KT0006 核蛋白與胞漿蛋白提取試劑盒 50T, 200T

AMJ-KT0007 總蛋白提取試劑盒 50T, 200T

AMJ-KT0008 BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒（兼容SDS） 500T, 2000T, 5000T

AMJ-KT0009 Bradford 蛋白質(zhì)定量試劑盒（兼容DTT） 500T, 2000T, 5000T