膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)和結(jié)締組織中含量zui豐富的不溶性蛋白質(zhì)。它可以在皮膚，肌腱，骨、軟骨、肌肉、玻璃體和韌帶等組織。有超過16種特征鮮明的類型膠原蛋白，但I型、II型和III型膠原蛋白在哺乳動(dòng)物中的含量超過80%。膠原的三重螺旋結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜*之處：它由一個(gè)基本三聚體的重復(fù)模式組成：甘氨酸-脯氨酸-羥脯氨酸。

在細(xì)胞中，膠原蛋白以前膠原的形式分泌這些鏈被運(yùn)輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)，在那里，大量的翻譯后修飾導(dǎo)致了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形成具有二硫鍵的三螺旋結(jié)構(gòu)。膠原蛋白的過度產(chǎn)生與病理狀況有關(guān)，包括肝硬化、肺結(jié)核和肺結(jié)核纖維化和腫瘤生長。BioVision的膠原蛋白檢測試劑盒是一種簡單、靈敏的檢測多種蛋白質(zhì)中少量膠原蛋白的檢測試劑盒樣品的數(shù)量。該分析基于樣品酸水解形成水解物和羥脯氨酸。這釋放了羥脯氨酸氧化形成反應(yīng)中間體，在反應(yīng)中進(jìn)一步形成發(fā)色團(tuán)（Abs 560 nm）。

那么，如何選擇快速方便的膠原蛋白檢測試劑盒試劑盒呢？接下來小艾要介紹的這款膠原蛋白檢測試劑盒 檢測方法簡單，對(duì)膠原蛋白敏感且特異，可在各種樣本（如組織勻漿）中檢測到低至0.5µg的膠原蛋白，生物液體和純化蛋白質(zhì)。

艾美捷 膠原蛋白檢測試劑盒檢測方案：

1、樣品制備：組織或蛋白質(zhì)/肽樣品：組織樣品（即肺）應(yīng)在ddH2O中均勻化，使用100µl

每10 mg組織使用ddH2O。向100µl樣品勻漿中添加100µl濃HCl（~12 M，未提供），并將其放入一個(gè)壓力合適的聚丙烯螺旋蓋小瓶中。在120°C下水解樣品3小時(shí)（見注釋C）。尿液：用等量水水解樣品壓力密封聚丙烯螺旋蓋小瓶中12m濃HCl（即100µl尿液+100µl HCl）的體積。之后均質(zhì)，通過添加4 mg活性炭，用活性炭澄清樣品。以10000 x g的速度旋轉(zhuǎn)并離心3小時(shí)至少清除沉淀和活性炭。如果需要，重復(fù)上述步驟。將2-30µl各水解樣品轉(zhuǎn)移至96孔板中，并通過在熱板/干熱塊或微孔板培養(yǎng)箱上70°C加熱板蒸發(fā)至干燥。

2、標(biāo)準(zhǔn)品制備：將25µl膠原蛋白I標(biāo)準(zhǔn)品轉(zhuǎn)移到一個(gè)帶螺絲帽的壓力密封聚丙烯小瓶中，并添加25µl膠原蛋白12 M濃鹽酸（未提供）。牢固擰緊蓋并在120°C下水解3小時(shí)。在冰上冷卻小瓶，然后旋轉(zhuǎn)小瓶內(nèi)容物（zui終體積為50µl，zui終濃度為1 mg/ml水解膠原蛋白）。添加0、2、4、6、8和10µl的1mg/ml水解I型膠原標(biāo)準(zhǔn)溶液放入96孔板中的一系列孔中，生成0、2、4、6、8和10的當(dāng)量µg膠原蛋白/孔。通過在熱板/干熱塊上70°C加熱板，將標(biāo)準(zhǔn)曲線井蒸發(fā)至干燥，或微孔板培養(yǎng)箱。注：為防止微孔板塑料翹曲/蝕刻，請(qǐng)勿將微孔板暴露在J端溫度（>85°C）下。如果天氣炎熱使用平板/烤箱時(shí)，我們建議將微孔板放置在70°C下，直到內(nèi)容物*蒸發(fā)

3、反應(yīng)：向每個(gè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品中添加100µl氯胺T試劑，并在室溫下培養(yǎng)10分鐘。添加向每個(gè)孔中加入100µl DMAB試劑，并在60°C下培養(yǎng)90分鐘。

4、測量：將板從熱源上取下，并在560處測量所有樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線孔的吸光度端點(diǎn)模式下的nm（OD560）。對(duì)于zui大信號(hào)強(qiáng)度，在將板從加熱爐中取出后20分鐘內(nèi)測量吸光度

5、計(jì)算：對(duì)于膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，從所有標(biāo)準(zhǔn)中減去零標(biāo)準(zhǔn)（0μg/孔試劑空白）讀數(shù)

，繪制背景減去值并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。對(duì)于測試樣品，減去零從樣品讀數(shù)中讀取標(biāo)準(zhǔn)（0μg/孔試劑空白），并將背景減去的OD560值應(yīng)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線，以在井中獲得Bμg膠原蛋白。