電泳允許通過 SDS-PAGE 分離的蛋白質(zhì)通過電泳轉(zhuǎn)移從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上。在我們的蛋白質(zhì)印跡指南的第 3 部分中，Jackson公司詳細(xì)介紹了電印跡的過程以及對(duì)其成功至關(guān)重要的一些注意事項(xiàng)。

在通過 SDS-PAGE 進(jìn)行電泳之后，通過電泳轉(zhuǎn)移將分離的蛋白質(zhì)從凝膠上電印跡到膜上。聚丙丨烯酰胺凝膠和轉(zhuǎn)移膜在被夾在負(fù)電J（陰J）和正電J（陽J）之間之前直接接觸。

陰J放置在凝膠后面，陽J放置在膜后面。當(dāng)施加電壓時(shí)，蛋白質(zhì)從凝膠遷移到膜，在那里它們被固定。結(jié)果是膜上凝膠圖案的鏡像。然后在免疫檢測(cè)之前封閉印跡（電印跡膜）。

圖：使用電印跡槽將蛋白質(zhì)從 SDS-PAGE 凝膠轉(zhuǎn)移到膜上。

Jackson公司：膜的類型

膜可由硝酸纖維素或聚偏二氟乙烯 (PVDF) 制成。

硝酸纖維素

硝酸纖維素膜是非疏水性的，被認(rèn)為通過非共價(jià)力與蛋白質(zhì)相互作用——靜電和疏水特性。

硝酸纖維素很容易水合，并為大多數(shù)檢測(cè)方法提供低背景信號(hào)。

然而，硝酸纖維素膜在干燥后會(huì)變脆，如果要進(jìn)行替代蛋白質(zhì)的剝離和重新檢測(cè)，則難以處理。

聚偏氟乙烯

PVDF 膜具有化學(xué)惰性，比硝酸纖維素膜更堅(jiān)固，便于剝離和重新探測(cè)替代蛋白質(zhì)。PVDF 是疏水的，通過疏水和偶J相互作用與蛋白質(zhì)相互作用。因此，與硝酸纖維素膜相比，它們可以形成更強(qiáng)的相互作用，使它們能夠結(jié)合更多的蛋白質(zhì)（~150 µg cm2）。

然而，更大的膜蛋白親和力可能會(huì)增加膜與一抗和二抗相互作用的可能性，從而增加背景信號(hào)的可能性。

PVDF 可能會(huì)自發(fā)熒光，如果要進(jìn)行熒光檢測(cè)以避免背景信號(hào)，則必須使用低熒光 PVDF 膜。由于 PVDF 的疏水性，膜在印跡之前需要在甲醇中“潤(rùn)濕"。這使緩沖液能夠滲透基質(zhì)并使蛋白質(zhì)與膜結(jié)合。

Jackson公司：Western Blotting 轉(zhuǎn)移步驟中需要考慮的因素

毛孔大小

如果感興趣的蛋白質(zhì)特別小或特別大，則可能需要考慮膜孔徑。

較大的孔允許更大范圍的蛋白質(zhì)尺寸，但會(huì)增加小蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)移過程中穿過膜的風(fēng)險(xiǎn)。

而較小的孔提供更大的結(jié)合表面，增加結(jié)合能力并減少小蛋白質(zhì)通過膜的機(jī)會(huì)。結(jié)合孔徑大小，應(yīng)考慮蛋白質(zhì)濃度。

雖然膜和蛋白質(zhì)之間的高結(jié)合親和力確保了足夠的蛋白質(zhì)結(jié)合以進(jìn)行準(zhǔn)確的分析/檢測(cè)，但在高蛋白質(zhì)濃度下，這可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)自結(jié)合而不是蛋白質(zhì)-膜相互作用，并在洗滌步驟中導(dǎo)致蛋白質(zhì)損失。

洗滌步驟

SDS 可以抑制蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，因此聚丙丨烯酰胺凝膠可以用去離子水洗滌，然后放入轉(zhuǎn)移緩沖液中 15-30 分鐘以與緩沖液平衡。

然而，在此過程中，小蛋白可能會(huì)從凝膠中遷移出來，因此在執(zhí)行洗滌步驟之前應(yīng)仔細(xì)考慮。懷疑樣品含有具有許多疏水性氨基酸或高分子量的蛋白質(zhì)，可以使用具有低濃度 SDS（0.02 至 0.1%）的轉(zhuǎn)移緩沖液來防止其沉淀。

緩沖液 pH

轉(zhuǎn)移緩沖液保持高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的 pH 值，確保它們保持負(fù)電荷并向陽J遷移。

常見的轉(zhuǎn)移緩沖液使用 Towbin 系統(tǒng)（192 mM 甘氨酸、25 mM Tris、20% 甲醇）。這種低離子強(qiáng)度緩沖液的 pH 值為 8.3，高于大多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。

除了鹽的類型和濃度，添加酸性或堿性溶液來調(diào)節(jié) pH 值會(huì)影響離子含量，從而影響緩沖液的電導(dǎo)率。

高離子水平會(huì)導(dǎo)致運(yùn)行溫度升高，這可能會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)移效率低下并增加不良偽影的可能性。

添加甲醇

可以將甲醇 (MeOH) 添加到轉(zhuǎn)移緩沖液中以提高蛋白質(zhì)膜轉(zhuǎn)移效率。添加 MeOH 可能會(huì)導(dǎo)致凝膠收縮，增加凝膠密度并延緩遷移，特別是對(duì)于高分子量蛋白質(zhì)。

為了防止這種情況，凝膠在增加體積的甲醇中平衡，直到達(dá)到所需的濃度。

建議使用分析級(jí) MeOH，因?yàn)檩^低級(jí)別的甲醇可能含有金屬雜質(zhì)，會(huì)損壞儀器，因此應(yīng)避免使用。

應(yīng)在使用前添加 MeOH，以防止緩沖液變質(zhì)或溶劑蒸發(fā)。

電壓

組裝好凝膠膜夾層后，將盒子放入緩沖液罐中，并施加電壓以驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上。

施加電壓的電壓強(qiáng)度和周期會(huì)影響蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移的效率，必須針對(duì)每個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化。

短時(shí)間的低電壓會(huì)導(dǎo)致不*轉(zhuǎn)移，而長(zhǎng)時(shí)間的高電壓會(huì)加熱系統(tǒng)，導(dǎo)致不正確的轉(zhuǎn)移。

高電壓也可能導(dǎo)致小蛋白質(zhì)通過膜而不結(jié)合。這可以通過在個(gè)膜后面放置一個(gè)額外的膜來捕獲這些多肽來觀察。

理想情況下，應(yīng)優(yōu)化條件以確保所分析的所有大小的蛋白質(zhì)都能令人滿意地轉(zhuǎn)移。

Jackson公司專注于親和純化的二抗和純化免疫球蛋白研究，服務(wù)領(lǐng)域覆蓋各大學(xué)科研所和醫(yī)院里的動(dòng)物研究以及生物醫(yī)學(xué)研究機(jī)構(gòu)的科學(xué)家。艾美捷科技是Jackson公司的中國代理商，為科研工作者提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù)。