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好的引物所具有的特點(diǎn)
閱讀：2167 發(fā)布時(shí)間：2022-8-8好的引物所具有的特點(diǎn)：
1、典型的引物18到24個(gè)核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨(dú)te性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會(huì)與錯(cuò)誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。
2、選擇GC含量為40％到60％或GC含量反映模板GC含量的引物。
3、設(shè)計(jì)5'端和中間區(qū)為G或C的引物。這會(huì)增加引物的穩(wěn)定性和引物同目的序列雜交的穩(wěn)定性。
4、避免引物對3'末端存在互補(bǔ)序列，這會(huì)形成引物二聚體，抑制擴(kuò)增。
5、避免3'末端富含GC。設(shè)計(jì)引物時(shí)保證在最后5個(gè)核苷中含有3個(gè)A或T。
6、 避免3'末端的錯(cuò)誤配對。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。
7、避免存在可能會(huì)產(chǎn)生內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)的序列，這會(huì)破壞引物退火穩(wěn)定性。
目的序列上并不存在的附加序列，如限制位點(diǎn)和啟動(dòng)子序列，可以加入到引物5'端而不影響特異性。當(dāng)計(jì)算引物Tm值時(shí)并不包括這些序列，但是應(yīng)該對其進(jìn)行互補(bǔ)性和內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)的檢測。
有時(shí)候，僅有有限的序列信箱可供用于引物設(shè)計(jì)。比如，如果僅知道氨基酸序列，可以設(shè)計(jì)簡并引物。簡并引物是指代表編碼單個(gè)氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。為了增加特異性，可以參考密碼子使用表，根據(jù)不同生物的堿基使用偏好，減少簡并性。次黃嘌lìng可以同所有的堿基配對，降低引物的退火溫度。不要在引物的3'端使用簡并堿基，因?yàn)?'端最后3個(gè)堿基的退火足以在錯(cuò)誤位點(diǎn)起始PCR。使用較高的引物濃度（1μM到3μM），因?yàn)樵S多簡并混合物中的引物不是特異性針對目的模板。