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PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)問題分析
閱讀：193 發(fā)布時(shí)間：2024-2-18 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)是在體外進(jìn)行的由引物介導(dǎo)的酶促DNA擴(kuò)增反應(yīng)。PCR的原理是在模板DNA、PCR引物、四種脫氧核糖核苷酸(dNTP)及適當(dāng)濃度的Mg2+存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的體外酶促合成反應(yīng)。兩個(gè)引物分別位于靶序列兩端，同兩條模板的3’端互補(bǔ)，由此限定擴(kuò)增片段。PCR反應(yīng)由一系列的變性→退火→延伸反復(fù)循環(huán)構(gòu)成，即在高溫下模板雙鏈DNA變性解鏈，然后在較低溫度下同過量引物退火，再在適中溫度下由DNA聚合酶催化進(jìn)行延伸。理論上，經(jīng)過N次循環(huán)可使特定片段擴(kuò)增到2n-1，考慮到擴(kuò)增效率達(dá)不到100%，所以通常經(jīng)25到30次循環(huán)可擴(kuò)增到106倍，足夠后續(xù)實(shí)驗(yàn)展開。
擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)多條帶(雜帶)：
1、 引物用量偏大，引物的特異性不高。應(yīng)調(diào)換引物或降低引物的使用量。
2、循環(huán)的次數(shù)過多。適當(dāng)增加模板的量，減少循環(huán)次數(shù)。
3、 酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好，應(yīng)降低酶量或調(diào)換另一來源的酶。
4、退火溫度偏低，退火及延伸時(shí)間偏長(zhǎng)。應(yīng)提高退火溫度，減少變性與延伸時(shí)間，也可采用二種溫度的PCR擴(kuò)增。以2度為梯度設(shè)計(jì)梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。
5、 樣品處理不當(dāng)。
6、 Mg2+濃度偏高，因適當(dāng)調(diào)整Mg2+使用濃度。
7、 若為PCR試劑盒，也可能時(shí)試劑盒本身質(zhì)量有問題。
8、 復(fù)制提前終止。使用非熱啟動(dòng)的聚合酶時(shí)常有發(fā)生。冰上準(zhǔn)備反應(yīng)體系或采用熱啟動(dòng)聚合酶。
9、 反應(yīng)緩沖液未全融化或未充分混勻。確保反應(yīng)緩沖液融化全并全混勻。
10、 引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計(jì)引物。
11、 引物量過多。減少反應(yīng)體系中引物的用量。
12、 模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng，而基因組DNA則應(yīng)<200ng。
13、 外源DNA污染。確保操作的潔凈。