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PCR實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)失敗結(jié)果探究
閱讀：141 發(fā)布時(shí)間：2025-3-11聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）模擬體內(nèi)DNA復(fù)制條件，應(yīng)用DNA聚合酶反應(yīng)，體外程序化地特異性擴(kuò)增某一DNA片段的技術(shù)。PCR的最大特點(diǎn)，是能將微量的DNA大幅增加。
一 、模板質(zhì)量問(wèn)題：
1）模板提取不完整，其中不含你的目的基因，或目的基因含量太低?？梢耘軅€(gè)電泳看看提取的DNA，PCR陽(yáng)性樣品與陰性樣品是否有明顯差別。如果確定是這種問(wèn)題，可以增加模板量試試，但不一定行得通?！?/span>
2）模板里面殘留某種試劑成份，可能抑制Taq聚合酶的活性，如果是這種情況，可以用試劑盒把模板再純化一下，或?qū)⒛０遄鰝€(gè)梯度稀釋以確定最佳的模板量
3） 為什么跑電泳會(huì)出現(xiàn)拖帶呢？
1. 有可能的因?yàn)槟愕碾妷赫{(diào)的太高了。電泳跟很多因素有關(guān)，其中就有一個(gè)是電壓，在適當(dāng)?shù)碾妷悍秶鷥?nèi)增加是可以加快遷移速率，但是要是超到一個(gè)臨界值反而有害。你可以適當(dāng)?shù)恼{(diào)低點(diǎn)看看。
2.有時(shí)候發(fā)現(xiàn)上樣量太多的話(huà)會(huì)有拖帶。你看能否回收之后 ，按1:50 或1:100 等稀釋后，再當(dāng)成模板擴(kuò)一次怎么樣。
二 、引物問(wèn)題
1）樣品自身的基因型差異導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。也就是說(shuō)你的引物與某些基因型的樣品結(jié)合的好，而和另一些基因型結(jié)合不好?？梢該Q一對(duì)更保守的引物試試。祝順利！
2）普通PCR所用的一對(duì)引物中有一個(gè)引物加多了，為正常的三倍只要引物特異性比較好，那么不會(huì)產(chǎn)生大的影響。如果恰巧是加多的這條引物不是很特異的話(huà)，也許會(huì)擴(kuò)出來(lái)非特異帶。
在制備單鏈探針時(shí)候就采取這樣的不對(duì)稱(chēng)pcr，沒(méi)關(guān)系的三Taq酶處于失活狀態(tài)。因?yàn)榛钚越档土四艹霈F(xiàn)二聚體。
三、Taq酶處于失活狀態(tài)。因?yàn)榛钚越档土四艹霈F(xiàn)二聚體。
四、模板濃度過(guò)低。
五、退火溫度過(guò)高。有可能，可以做個(gè)梯度PCR試一下。
六、循環(huán)次數(shù)過(guò)少或延伸時(shí)間過(guò)短以致目的基因擴(kuò)增量不夠。這個(gè)可能性不大。
七、dNTP濃度低時(shí)PCR產(chǎn)率及特異性均增高，適合于用擴(kuò)增摻入法標(biāo)記生物素及放射性元素。當(dāng)100μl PCR液中含dNTP各40μmol/L時(shí)就足以合成2.6μg的DNA（dNTP消耗一半）,所以,你不小心多加了4倍的量,會(huì)很影響PCR結(jié)果,即Taq酶活力要降低20～30%，即底物抑制。
八、PCR產(chǎn)物電泳
1.電泳圖不清晰，可能電泳緩沖液和制膠緩沖液濃度不準(zhǔn)或者臟了吧。換新的電泳緩沖液和制膠緩沖液試試。marker都出問(wèn)題說(shuō)明是膠的問(wèn)題，或者電泳操作的問(wèn)題。
2. PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過(guò)高，Mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起。