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熒光定量PCR總RNA提取步驟
閱讀：321 發(fā)布時間：2023-8-71、A組織樣本：
迅速將新鮮的組織切成合適的大小，在液氮中充分研磨后加裂解液裂解，或直接加入裂解液后用勻漿器勻漿。每30-50mg組織加1ml Trizol。
2、B全血樣品：
加入3-5倍體積的紅細胞裂解液到血樣中，室溫孵育10min，室溫3500rpm離心6min。棄上清，原每2-3ml全血樣品加1mL Trizol。
3、C細胞樣品：
懸浮液中生長的細胞，通過離心收集細胞后，每1×105?106細胞加入1mL Trizol，移液器吹打混勻，直接裂解或-80℃儲存一個月。貼壁生長的細胞，有兩種處理方法。一種是移除培養(yǎng)基后，將1mL Trizol直接加入直徑3.5cm的培養(yǎng)皿中裂解細胞?；蚴窍扔靡鹊鞍酌笇①N壁細胞消化下來并收集后，再加入1mL Trizol進行裂解。（Note：加入Trizol前, PBS充分洗滌細胞去除殘余培養(yǎng)基。）
4.1、 直接法
1）、加入1ml Trizol試劑，混勻，冰上孵育10min。
2）、4℃，12000rpm離心10min，小心轉移上清液到不含顆粒的新EP管中。
3）、加入200ul氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫孵育5min。
4）、4℃，12000rpm離心15min?；旌弦悍秩龑?，包括最下面的苯酚 - 氯仿有機相，中間相和上層水相。小心轉移上層水相到新的EP管（大約60％體積的Trizol），不要吸取中間相，可留下少量上層液體?。∟ote：質量比數(shù)量更重要?。?/p>
5）、加入等體積的異丙醇，輕輕地顛倒混勻約10次，室溫放置10min。
6）、4℃，12000rpm離心10min。棄上清，1ml 75％乙醇洗滌RNA沉淀兩次。
7）、4℃，12000rpm離心5min，棄上清，室溫下風干5-10min（不要太干，過度干燥會導致RNA難溶解?。?。將RNA溶于15μl-50μlDEPC水中。
8）、立即進行反轉錄反應，或先-80℃長期保存。
4.2、 離心柱法
1）、4.1中步驟1）—4）。
2）、加入1/2體積的無水乙醇，輕柔顛倒混勻。如有透明的纖維狀物體，不影響下游步驟。
3）、將所有裂解物/乙醇混合物轉移至離心柱，置于2mL，靜置2min。4℃，12000rpm離心3min，棄廢液。
4）、加入500uL洗滌液，靜置2min。4℃，12000rpm離心30秒，棄廢液。重復一次。
5）、4℃，10,000rpm離心2min以除去殘留的乙醇。
6）、將離心柱置于新的RNase-free EP管中，加入30ul-50ulDEPC水，靜置5min， 12000rpm離心2min收集。
7）、立即進行反轉錄反應，或先-80℃長期保存。