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Cy3/5/7 NHS ester和帶氨基多肽和抗體連接實(shí)驗(yàn)方法及步驟
閱讀：1514 發(fā)布時(shí)間：2018-7-23Cy3/5/7 NHS ester和帶氨基多肽和抗體連接實(shí)驗(yàn)方法及步驟
Cy3 NHS ester, Cyanine5 NHS ester和Cyanine7 NHS ester可以標(biāo)記含有amine的多肽，抗體，蛋白，DNA和寡核苷酸及其他小分子。在反應(yīng)條件下NHS可以和NH2發(fā)生反應(yīng)，從而連接到一起。
（一）：Cyanine5 NHS ester和多克隆抗體的連接實(shí)驗(yàn)方法和步驟
【準(zhǔn)備材料】：
Cy3 NHS ester purchased from xi an ruixibio
anti-GST多克隆抗體purchased from Abcam
【實(shí)驗(yàn)步驟】：
1.在1 L 0.15 M NaCl 溶液中透析anti-GST抗體(濃度為 0.5 mL at3 mg/mL)，常溫透析4小時(shí)。
2.在4°C用新鮮的1 L 0.15 M NaCl 溶液再透析過(guò)夜。
3.第二天用1 L 0.1 M NaHCO3 (pH 8.3)透析4小時(shí)。
4.用0.22 μm注射器過(guò)濾頭過(guò)濾抗體溶液。
5.用0.1 M NaHCO3 稀釋少量的抗體，在280nm處測(cè)其紫外吸收值計(jì)算標(biāo)記抗體的總量 (IgG antibody摩爾吸光系數(shù)170 000 M-1 cm-1 at 280 nm).
6.用DMSO配置Cy3 NHS (MW 616.19)溶液濃度為10 mg/mL;計(jì)算所需體積以得到想要的Cy3NHS 和抗體的比值(例如20:1)，然后慢慢將其加入到抗體溶液中，同時(shí)在暗處常溫緩慢攪拌45分鐘。
7.用1 L 0.15 M NaCl 溶液常溫避光透析4小時(shí)除去未標(biāo)記上的Cy5。
8.在4°C用新鮮的1 L 0.15 M NaCl 溶液再避光透析過(guò)夜。
9.用1 L of 0.01 M PBS/ 0.01% NaN3溶液常溫避光透析4小時(shí), 在4°C常溫避光再次透析過(guò)夜。
10. 用0.22 μm注射器過(guò)濾頭過(guò)濾抗體溶液。
11. 用0.01 M PBS/0.01 % NaN3整數(shù)倍稀釋標(biāo)記抗體溶液，測(cè)量280nm(蛋白)和552nm(Cy)處的紫外可見(jiàn)吸光度。
12. 產(chǎn)品冷凍干燥成粉末或在0.01 M PBS/ 0.01% NaN3溶液中，-20℃避光儲(chǔ)存。
F/P計(jì)算：
Cy3在552nm摩爾吸光系數(shù)為150 000M-1 cm-1;此蛋白在280nm的摩爾吸光系數(shù)為170 000 M-1 cm-1;
不同蛋白的摩爾吸光系數(shù)不一樣;.Cy3染料本身在280 nm 的吸收是552nm處的8%。按以下公式計(jì)算F/P
值。
[Cy3] = A552/150000
[antibody] = {A280 - (0.08×A552)}/170000
F/P final= [Cy3]/[antibody]= {1.13×A552}/{A280 - (0.08×A552)}
（二）：Cyanine5 NHS ester和標(biāo)記 (D-ser2)-leucineenkephalin的連接實(shí)驗(yàn)方法和步驟
【準(zhǔn)備材料】：
Cy5 NHS ester purchased from xi an ruixibio
(D-ser2)-leucineenkephalin purchased fromsigma
【實(shí)驗(yàn)步驟】：
1.Cy5 NHS 1.0 mg 溶解于400 μL DMSO后，加入到1mL 的玻璃瓶中盛有(D-ser2)-leucine-enkephalinacetate(YSGFLT, 0.75 mg) 的400 μL DMSO溶液。(Dye 和peptide 投料比是 1:1)
2.然后加入15 μL三乙胺，常溫避光攪拌反應(yīng)混合物過(guò)夜。
3.用HPLC 純化蛋白，使用蛋白C18柱子(25 cm×10 mm)，每次上樣注入2×400 μL，30分鐘梯度洗脫從0.1% TFA水溶液到MeCN∶H2O(0.1% TFA)=70∶30，流速4mL /min。(對(duì)不同的蛋白選擇不同的合適HPLC梯度流動(dòng)相)
4.收集適當(dāng)?shù)纳珟Х?，?biāo)記多肽的保留時(shí)間比未標(biāo)記的多肽長(zhǎng)。
5.產(chǎn)品冷凍干燥成粉末或在水溶液中，-20℃避光儲(chǔ)存;必要時(shí)可用質(zhì)譜表征。
6.CyDye標(biāo)記的蛋白穩(wěn)定性取決于蛋白本身。例如標(biāo)記的IgG在4 ℃可避光保存2月;更長(zhǎng)期的保存需加入等體積的甘油-20 ℃避光保存.
F/P計(jì)算：
Cy5 在650 nm 的摩爾吸光系數(shù)為250 000 M-1 cm-1 ，所用蛋白在280 nm處的摩爾吸光系數(shù)為 170
000 M-1 cm-1;Cy5在280nm處的吸收是650nm處的5%。按以下公式計(jì)算F/P值。
[Cy5 dye] = (A650)/250 000
[peptide] =[A280 -(0.05×A650)]/170 000
F/P final= [dye]/[peptide]= {0.68×A650}/{A280 - (0.05×A650)}
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陜西新研博美生物科技有限公司產(chǎn)品種類(lèi)：
Cyanine3 alkyne
Cyanine3 azide
Cyanine3 carboxylic acid 1144107-76-5
Cyanine3 hydrazide
Cyanine3 maleimide
Cyanine3 NHS ester 1032678-38-8
Cyanine3.5 azide
Cyanine3.5 carboxylic acid 1144107-79-8
Cyanine3.5 NHS ester
Cyanine5 alkyne
Cyanine5 amine
Cyanine5 azide
Cyanine5 Boc-hydrazide
Cyanine5 carboxylic acid
Cyanine5 hydrazide
Cyanine5 maleimide
Cyanine5 NHS ester 1032678-42-4
Cyanine5.5 alkyne
Cyanine5.5 azide
Cyanine5.5 carboxylic acid 1144107-80-1
Cyanine5.5 maleimide
Cyanine5.5 NHS ester
Cyanine7 amine 1650635-41-8
Cyanine7 azide
Cyanine7 carboxylic acid
Cyanine7 maleimide
Cyanine7 NHS ester
Cyanine7.5 amine
Cyanine7.5 azide
Cyanine7.5 carboxylic acid 1686147-68-1
Cyanine7.5 maleimide
Cyanine7.5 NHS ester
Sulfo-Cyanine 5 NHS ester
Sulfo-Cyanine3 azide
Sulfo-Cyanine3 carboxylic acid
Sulfo-Cyanine3 maleimide
Sulfo-Cyanine3 NHS ester
Sulfo-Cyanine5 alkyne
Sulfo-Cyanine5 azide
Sulfo-Cyanine5 carboxylic acid 1121756-16-8
Sulfo-Cyanine5 maleimide
Sulfo-Cyanine7 azide
Sulfo-Cyanine7 carboxylic acid
Sulfo-Cyanine7 NHS ester
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