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在生物制品、醫(yī)療器械等產(chǎn)品的整個生產(chǎn)階段，無論是原輔料、過程產(chǎn)品的過程檢測還是終產(chǎn)品的放行檢測中，細(xì)菌內(nèi)毒素檢測（BET）都是需要的環(huán)節(jié)，如果內(nèi)毒素檢測出現(xiàn)假陰性，那么有潛在內(nèi)毒素的產(chǎn)品有可能被放行到市場中，引起發(fā)熱、休克甚至更重大的事故。

小伙伴們是不是也經(jīng)常被假陰性折磨呢，本期小編帶你了解如何應(yīng)對BET假陰性！

什么是假陰性

對于凝膠法，當(dāng)供試品內(nèi)毒素濃度≥2倍檢測試劑的靈敏度，但檢測結(jié)果仍為陰性，則說明BET假陰性。對于光度法，若內(nèi)毒素的回收率＜50%，則說明在此試驗條件下供試品溶液存在抑制干擾，導(dǎo)致內(nèi)毒素檢測不出來。

造成假陰性的干擾因素及解決方案

供試品的干擾

• pH值

BET機理是酶促反應(yīng)，而酶的反應(yīng)條件相對來講比較嚴(yán)苛，因此要求供試品溶液和鱟試劑混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范圍內(nèi)，過高或過低的pH都會抑制反應(yīng)，出現(xiàn)假陽性。

若不在6.0～8.0范圍，建議使用廠家提供的緩沖Buffer稀釋調(diào)節(jié)，如Tris Buffer。

• 二價陽離子

內(nèi)毒素激活鱟試劑中的酶需要二價陽離子，如Mg2+的參與，若供試樣品中存在的肝素或EDTA等成分螯合陽離子，二價陽離子濃度不足時，便抑制反應(yīng)，導(dǎo)致假陰性的出現(xiàn)。為了克服金屬離子螯合劑的抑制干擾，可用MgCl2稀釋供試品。

與Mg2+不同，Ca2+不會激活BET反應(yīng)，而是具有非常強烈的抑制作用，因此存在Ca2+的供試品可用LRW稀釋。

• 高滲透壓

過高濃度的鹽或糖溶液會脫去蛋白質(zhì)中的水分子，使蛋白質(zhì)變性，出現(xiàn)抑制干擾?？赏ㄟ^稀釋供試品去除干擾。

• 酶抑制劑

人血漿中的絲氨酸蛋白酶抑制劑會抑制內(nèi)毒素激活鱟試劑?？捎肔RW稀釋10倍，再70±2℃加熱10 min破壞抑制劑，進(jìn)而去除干擾。

• 屏蔽內(nèi)毒素

血漿蛋白組分、電解質(zhì)溶液和脂質(zhì)乳劑等有結(jié)合內(nèi)毒素的特性，如脂質(zhì)乳劑的兩親性對疏水的內(nèi)毒素具有親和力，脂類包裹內(nèi)毒素，使內(nèi)毒素?zé)o法暴露出來，實驗結(jié)果將出現(xiàn)假陰性?？赏ㄟ^添加分散劑的方式去除抑制干擾。

操作（包括操作環(huán)境）

• 操作

鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素反應(yīng)后形成的凝膠比較脆弱，容易受到震動等劇烈操作而變形，將檢測結(jié)果誤判為陰性。

因此對于凝膠法，在溫育過程和取放反應(yīng)管時一定要輕柔操作，避免安瓶或試管左右晃動，且在保溫過程中不可隨時取出觀察。

• 反應(yīng)溫度

鱟試劑的靈敏度對溫度較敏感，反應(yīng)溫度在25~40℃之間，一般設(shè)置37°C ± 1°C。溫度過高，會破壞鱟試劑，從而達(dá)不到檢測目的。

實驗耗材、器具

• 檢測器具

在稀釋標(biāo)準(zhǔn)品等操作過程中要用到一些器具，建議選擇玻璃器材，非塑料制品，因為塑料制品容易吸附內(nèi)毒素，造成BET反應(yīng)內(nèi)毒素不足。

• 表面活性劑

高濃度表面活性劑會使鱟試劑中的蛋白質(zhì)變性，形成抑制。因此所用器具在用洗滌劑清洗后要沖洗干凈并滅菌，供試品溶液可通過LRW稀釋來降低干擾。

細(xì)菌內(nèi)毒素檢測試劑怎么選