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在近期的網絡研討會中，來自美國MImAbs的科學總監(jiān)Fran?ois Romagné博士討論了針對困難靶點的抗體發(fā)現(xiàn)策略。他們使用mRNA免疫和Beacon單B細胞抗體發(fā)現(xiàn)平臺，加速獲得大量針對難以靶向的G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）和離子通道的具有分子功能多樣性的抗體。

從雜交瘤平臺到Beacon®單細胞抗體發(fā)現(xiàn)

MImAbs是一個專注于發(fā)現(xiàn)和表征免疫治療抗體的研發(fā)平臺。MImAbs初期建立雜交瘤抗體平臺，其平均篩選通量為2000-3000個克隆，從免疫小鼠到純化得到leads抗體的時間需要4.5個月到5個月（圖1）。由于篩選的通量較低，得到最終可用于下游驗證的抗體數和抗體多樣性可能不足，尤其是針對一些困難抗原的時候。

圖1. MImAbs基于雜交瘤的抗體發(fā)現(xiàn)流程

MImAbs在2022年初采購Beacon®平臺，在過去的兩年中已經開展了20余個campaigns，對比發(fā)現(xiàn)Beacon®在普通靶點的抗體發(fā)現(xiàn)中具有更加快速高效的特征，篩選出的hits數目是雜交瘤的10倍以上（圖2）。在針對GPCR和離子通道等困難抗原的campaign當中，Beacon®的單B細胞抗體發(fā)現(xiàn)流程更是展現(xiàn)出巨大優(yōu)勢。

圖2. MImAbs基于Beacon®的抗體發(fā)現(xiàn)流程

GPCR和離子通道抗體發(fā)現(xiàn)難點

GPCR（G Protein-Coupled Receptor），即G蛋白偶聯(lián)受體，是一大類膜蛋白受體的統(tǒng)稱，也是人類基因組編碼的最大蛋白家族，參與機體發(fā)育以及多種生理功能的調控，是重要的藥物靶點。GPCR的主體由7段跨細胞質膜的α螺旋結構構成，將信號由胞外轉導到胞內。但是其N端的胞外區(qū)域只有40aa，其他的胞外的loop則更小。同為跨膜蛋白復合物的離子通道，是繼GPCR之后用于藥物發(fā)現(xiàn)的第二大類膜蛋白。離子通道胞外區(qū)不包含N-末端及C-末端，胞外區(qū)小且表位有限。這些特征讓這兩類蛋白缺乏足夠的免疫原性來在哺乳動物宿主中產生強大的抗體反應，而且難以表達重組蛋白用于傳統(tǒng)的高通量抗體篩選。

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案例一：GPCR抗體發(fā)現(xiàn)

在最初針對GPCR的抗體發(fā)現(xiàn)，由于使用肽段的免疫效果不佳，無法檢測到抗體滴度，改用細胞免疫后雖檢測到抗體滴度，但在三個使用雜交瘤的campaign中都沒有成功篩選到抗體。研究者在改進免疫方案，使用了全長的mRNA進行小鼠免疫，或mRNA聯(lián)合細胞進行共同免疫，抗體滴度均得到有效提高（圖3）。

圖3. mRNA免疫策略得到更高抗體滴度

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然而，在使用共計12只免疫小鼠進行雜交瘤抗體發(fā)現(xiàn)過程中，共計篩選了5229個雜交瘤克隆，只找到一個陽性的克隆。而更早的超過10只細胞免疫小鼠的抗體發(fā)現(xiàn)則是一無所獲。

MImAbs使用同批次免疫的小鼠，利用Beacon®進行漿B細胞抗體篩選，通過基于細胞表達GPCR進行結合檢測以篩選陽性克隆。在Expt1（mRNA only）和Expt2 (mRNA+cells)中分別使用兩張11k芯片進行抗體篩選，最終得到37個經過體外驗證為真陽性的抗體分子（圖4）。

圖4. 雜交瘤和Beacon篩選GPCR抗體結果

被Beacon®篩選出來的陽性hits的VH和VL序列顯示出多樣性（圖5），前期發(fā)現(xiàn)抗體的多樣性為后續(xù)的選擇和開發(fā)提供了豐富的資源。

圖5. Beacon篩選出的抗體序列的多樣性

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案例二：離子通道抗體發(fā)現(xiàn)

離子通道蛋白的campaign中只使用mRNA免疫并沒有可檢測到的抗體滴度。嘗試使用細胞免疫或者聯(lián)合mRNA進行免疫，然而mRNA并沒有進一步增加小鼠血清中的抗體滴度。細胞免疫在大多數的小鼠中只引起了接近于背景信號的免疫反應。只有一只小鼠顯示出特異性的抗體滴度（#8），連同另外兩個低滴度的小鼠，被用于后續(xù)基于Beacon®的抗體發(fā)現(xiàn)（圖6）。

圖6. 離子通道的免疫策略和抗體滴度

在免疫效果更高的#8小鼠骨髓和脾臟漿B細胞中，Beacon®發(fā)現(xiàn)了30個經過驗證為陽性的hits。另外兩只滴度較低的小鼠內，Beacon®也篩選到15個陽性hits。其中30對VH-VH通過流式細胞術和瞬時轉染表達該靶點的細胞系進行驗證，12個VH-VL能夠結合表達了對應離子通道的細胞（圖7）。后續(xù)的研究工作還在進行當中。

圖7. 離子通道hits的流式細胞驗證結果

在研討會的最后，F(xiàn)ran?ois博士總結了Beacon®平臺在抗體發(fā)現(xiàn)中的優(yōu)勢：

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增加篩選的深度和多樣性

• 在每個campaign中，雜交瘤只能篩選2000-3000個克隆。

• Beacon®每次可以篩選40,000個克?。?張11k芯片）。

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在單細胞層面針對重組抗原和轉染細胞進行功能篩選

• 當重組抗原可及的時候，雜交瘤能夠提供相對足夠的抗體多樣性。

• 單細胞FACS只能篩選可包被在微珠表面的可溶性抗原；應用在記憶B細胞，相比于漿細胞分泌的抗體，膜表達IgG親和力更低。

• Beacon®篩選只測序經過了幾層篩選的hits序列：抗原識別、初步的功能（如阻斷）或者交叉反應。

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縮短從hit鑒定到重組表達和驗證的時間

• Beacon®單細胞操作節(jié)省了雜交瘤培養(yǎng)的時間。

• Hits回收（表達為重組mAbs）時無需基因合成。

• 基于Beacon®的流程在8周內完成高達100個hits的小規(guī)模生產（數量可以通過增加自動化進一步提高）。