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Luciferase報告基因系統(tǒng)是一種生物發(fā)光檢測系統(tǒng)，主要用于檢測基因的表達水平。它以熒光素（luciferin）為底物，通過檢測熒光素酶（luciferase）的活性來反映基因的表達水平。

在Luciferase報告基因系統(tǒng)中，熒光素酶可以催化熒光素氧化成氧化熒光素，在這個氧化過程中會發(fā)出生物熒光。這種熒光可以通過熒光測定儀或液閃測定儀進行測定。由于熒光素酶具有出色的靈敏度、使用方便且可定量檢測等優(yōu)點，Luciferase報告基因系統(tǒng)被廣泛應用于基因表達的檢測。

Luciferase報告基因系統(tǒng)的應用場景包括啟動子與轉錄因子互作檢測、藥物篩選、基因治療以及病毒載體的研究等。通過Luciferase報告基因系統(tǒng)可以快速、準確地檢測基因的表達水平，有助于深入了解基因的表達調控機制，為生物醫(yī)學研究提供有力支持，是檢測轉錄因子與目的基因啟動子區(qū) DNA 相互作用的一種檢測方法。

實驗原理：

轉錄因子是一種具有特殊結構、行使調控基因表達功能的蛋白質分子，也稱為反式作用因子。某些轉錄因子僅與其靶啟動子中的特異序列結合，這些特異性的序列被稱為順式作用元件。轉錄因子的DNA結合域和順式作用元件實現(xiàn)共價結合，從而對基因的表達起抑制或增強的作用。熒光素酶報告基因實驗（luciferase assay）是檢測這類轉錄因子和其靶啟動子中的特異順序結合的重要手段。熒光素酶報告基因實驗通過檢測熒光素酶的活性來反映基因的表達水平。當轉錄因子與順式作用元件結合后，可以激活或抑制熒光素酶的表達，從而影響熒光素酶的活性。通過比較不同條件或不同處理下熒光素酶的活性，可以了解轉錄因子與靶啟動子中的特異順序的結合情況，進一步揭示基因表達的調控機制。

原理簡述：

（1）構建一個將靶啟動子的特定片段插入到熒光素酶表達序列前方的報告基因質粒，如 pGL3-basic 等。

（2） 將要檢測的轉錄因子表達質粒與報告基因質粒共轉染HEK293T細胞或其它相關的細胞系。如果此轉錄因子能夠激活靶啟動子，則熒光素酶基因就會表達，熒光素酶的表達量與轉錄因子的作用強度成正比。

（3） 加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應，產(chǎn)生熒光，通過檢測熒光的強度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用。

實驗步驟：

1、實驗第一天，消化并接種細胞（根據(jù)具體實驗選擇合適的細胞）于 35 mm 細胞培養(yǎng)皿，置于 5％ CO2、飽和濕度的 37℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)過夜。

2、等細胞密度達到70％時用 Luciferase 報告基因質粒、LacZ 的表達質粒及其 它質粒（根據(jù)具體實驗確定）共轉染細胞（根據(jù)具體實驗選擇轉染方法，如磷酸鈣沉淀法、PEI、lipofectamine2000 等均可）。

3、轉染 24－36 小時后，吸去培養(yǎng)液，用冰冷的 PBS 洗滌細胞。注：熒光酶的酶促反應會被痕量的鈣所抑制，故用磷酸鈣轉染的細胞在收集細胞前應充分洗 滌除去含鈣介質。

4、在每個培養(yǎng)皿中加入 350 μl 預冷的 harvest buffer，于 4℃ 或冰上放置 10 min 裂解細胞。

5、在細胞裂解期間，準備足量的1.5 mL 微量離心管，將 ATP buffer 與 luciferin buffer 以 1：3.6 比例混合成反應液后分裝，每管 100 μl。

6、依次取等體積的細胞裂解液（100 μl）至步驟 5 中的離心管中，迅速混勻，在 發(fā)光儀（Luminometer）上讀取吸光值。注：發(fā)光反應會迅速衰減，將細胞裂解液加入反應液后 5 秒內必須讀取吸光值。

7、確保以相同操作手法讀取全部樣品吸光值后。

8、取剩余裂解液測定 LacZ 的活性，其讀數(shù)作為內標用以矯正熒光素酶的讀數(shù)。

9、用矯正后的讀數(shù)作圖，分析數(shù)據(jù)。注：熒光素見光易氧化，已稀釋未用的熒光素應丟棄。

注意事項：

1、為取得最佳測定效果，在用單管的熒光測定儀測定時，樣品和測定試劑混合后到測 定前的時間應盡量控制在相同時間內，例如 30 秒內。

2、由于溫度對酶反應有影響，所以測定時樣品和試劑均需達到室溫后再進行測定。

3、為保證熒光素酶檢測試劑的穩(wěn)定性，可以采取適當分裝后避光保存的方法，以避免 反復凍融和長時間暴露于室溫。一般來說，如果不分裝使用三次(期間凍融三次)，對測定結 果無明顯影響。

4、樣品和測定試劑混合后，必須等待 1-2 秒，再進行測定。測定時間通常為 10 秒，根 據(jù)情況也可以測定更長或更短時間，但是同一批樣品最好使用相同的測定時間。

5、為避免由于質粒轉細胞時效率的差異而帶來的誤差，可以同時轉入 Renilla 熒光素酶 的報告基因質粒作為內參，采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒進行檢測;也可以同時轉入 β-半乳糖甘酶報告基因質粒作為內參，然后采用β-半乳糖苷酶報告基因檢測試劑盒進行檢 測。采用熒光素酶報告基因檢測試劑盒中的報告基因細胞裂解液裂解獲得的樣品，可以直接 用于β-半乳糖苷酶報告基因檢測試劑盒中的測定。

逐典螢光素酶報告基因

針對報告基因檢測不同的側重需求，逐典推出了3種檢測系統(tǒng)。

逐典螢光素酶報告基因特點：

1. 檢測靈敏度高，信號穩(wěn)定性好

HEK293-NFK B-LUC細胞加入梯度稀釋的TNF 在37C、5%CO條件下刺激6小時后,分別用增強型、超敏型、穩(wěn)定型檢測試劑進行信號檢測。

2. 操作方便

僅需將底物和螢光素酶檢測緩沖液混合后直接加入到細胞即可。

3. 穩(wěn)定性好

同時在10次反復凍融實驗中，逐典全系列報告基因檢測試劑盒顯示出較強的穩(wěn)定性。