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引言
基于細胞活性和毒性檢測的實驗在基礎(chǔ)研究中有廣泛的應用，類似的實驗也用于臨床前研究，以表征化合物誘導的細胞毒性和副作用。相對于生物化學的方法，細胞實驗能夠提供更多的生理相關(guān)數(shù)據(jù)，如細胞增殖，形態(tài)和信號通路等。
ATPlite 1step 化學發(fā)光實驗使用代謝活性細胞中的 ATP 作為細胞活力的標志物。利用細胞凋亡和壞死時 ATP 濃度降低這一方法監(jiān)測化合物誘導的細胞毒性作用是非?？焖俸挽`敏的方法。
新面市的 VICTOR Nivo™ 多功能酶標儀其整合了光吸收，化學發(fā)光，熒光強度，時間分辨熒光以及熒光偏正五種檢測模式。VICTOR Nivo™ 讀板器提供基于微孔板頂部和底部的檢測，底部檢測模式允許蓋板蓋，并在細胞相關(guān)的實驗測定中實現(xiàn)更好的靈敏度。
材料和方法
在含有 10％ 胎牛血清 (FCS)，1％ 青霉素(100U / mL) /鏈霉素 (100μg/ mL) 的 Dulbecco's Modified Eagle 培養(yǎng)基 (DMEM) 中培養(yǎng)人肝細胞癌細胞 (HepG2，DSMZ no. ACC180) 2mM 谷氨酰胺。 將中國倉鼠卵巢細胞 (CHO-K1，DSMZ no.ACC 110) 放置在含 10％ FCS 和1％ 青霉素 (100U / mL) /鏈霉素 (100μg/ mL) 的 DMEM / F-12 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
ATPlite 1step 檢測方法：先將細胞潤洗，胰蛋白酶消化后重懸于細胞培養(yǎng)基中并轉(zhuǎn)移至 384 孔板（每孔 25μl 細胞懸液）或 96 孔板（每孔 100μl 細胞懸液）。（推薦使用 PerkinElmer 白色細胞培養(yǎng)板 CulturPlate-384，＃6007680或 CulturPlate-96，＃6005680）
24h 后，用 DMSO (終濃度為 0.5％v / v) 溶解化合物 (秋水仙堿，5-氟嘌呤，Pac1) 并使用 Echo 液體處理系統(tǒng) 550 (Labcyte，Inc)加樣。在37℃，5％ CO2 條件下孵育 48 小時。將凍干的熒光素酶底物溶于 ATPlite 1step 緩沖液中，并在細胞中加入底物 (25μl/ 384 孔板，96 孔板/100μl )。根據(jù)試劑盒說明書，在加入前將 ATPlite 試劑平衡至室溫。最后放入 VICTOR Nivo™ 酶標儀讀數(shù)。測試步驟中需要預先將額外的 60s 振蕩步驟添加到發(fā)光檢測步驟 (ATPlite Luminescence) 中。最后使用 GraphPad Prism 軟件進行數(shù)據(jù)分析。
結(jié)果
為了展示 VICTOR Nivo™ 酶標儀和 ATPlite 1step 方法對化合物的細胞毒性檢測，我們研究了其方法的穩(wěn)定性，靈敏度和動態(tài)范圍。
圖 1 ATP 的標準曲線滴定檢測該方法的線性和動態(tài)范圍。
圖 2 384 孔板中，細胞數(shù)目和檢測信號的相關(guān)性。
圖 3 96 孔板中，細胞數(shù)目和檢測信號的相關(guān)性。
圖 4 CHO-K1 細胞上的 DMSO 耐受結(jié)果。
圖 5 使用 CHO-K1 細胞，對秋水仙堿（A） ，5-氟尿嘧啶核苷（B），6-巰基嘌呤（C）的細胞毒性實驗評估。
圖 6 采用 Z’ 表針該實驗的穩(wěn)定性
表 1 使用 CHO-K1 細胞，采用 ATPlite 1step luminescence assay 測試得到的 CV 和 z’。分別采用秋水仙素和 DMSO 做為陽性和陰性對照。
結(jié)論
該研究展現(xiàn)了應用 ATPlite 1step luminescence assay 以及 VICTOR NIVO™ 多模式酶標儀檢測細胞毒性的成功案例。VICTOR NIVO™ 一體化的安裝化學發(fā)光檢測模式適用于對應的檢測方法并可靈活調(diào)整。
ATPlite 1step luminescence assay 簡易性和穩(wěn)定性的優(yōu)勢有利于對應的細胞系的條件優(yōu)化，動態(tài)范圍和線性條件符合方法開發(fā)的要求。高數(shù)值的 z’ 和低數(shù)值的誤差數(shù)據(jù)展現(xiàn)了該方法測試大量化合物的適用性。
