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抗體工程的最新進(jìn)展開啟了免疫治療的新篇章，導(dǎo)致了具有穩(wěn)定性、特異性和治療潛力的雙特異性抗體(bsAb) 的開發(fā)。由于工程化雙抗擁有兩個(gè)不同的抗原結(jié)合臂，致使雙抗的的生產(chǎn)變成了一個(gè)復(fù)雜且具有挑戰(zhàn)性的過程。具體挑戰(zhàn)包括：正確的鏈配對(duì)、同源二聚體污染、產(chǎn)量、正確的蛋白質(zhì)折疊和翻譯后修飾。以抗體設(shè)計(jì)為主導(dǎo)的解決方案和創(chuàng)新工藝技術(shù)的結(jié)合使得克服其中許多挑戰(zhàn)成為可能，雙抗生產(chǎn)的復(fù)雜過程需要強(qiáng)大且可靠的表達(dá)平臺(tái)，包括：

”

表達(dá)載體：

理想表達(dá)載體將目標(biāo)分子所有鏈以高比例進(jìn)行基因組整合和表達(dá)。盡管多表達(dá)盒載體可以提供便利，但將雙特異性抗體的每一半引入單獨(dú)的載體中，微調(diào)它們各自的表達(dá)水平亦可實(shí)現(xiàn)配對(duì)。

細(xì)胞系：

工程化雙特異性抗體的表達(dá)需要強(qiáng)大的宿主細(xì)胞系，廣泛使用的為中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO，因?yàn)樗粌H需要有效的鏈配對(duì)，還需要正確的翻譯后修飾、折疊和分泌。

早期質(zhì)量篩選：

細(xì)胞池和克隆篩選過程中的早期質(zhì)量分析有助于評(píng)估鏈配對(duì)效率、折疊模式和潛在的聚集風(fēng)險(xiǎn)。

工藝優(yōu)化：

即使使用優(yōu)化的細(xì)胞系和載體，同源二聚化仍然是雙特異性生產(chǎn)的潛在障礙。通過優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)過程和純化策略，提高所需分子的產(chǎn)量。

瑞孚迪（Revvity）的CHOSOURCE™蛋白表達(dá)平臺(tái)可以幫助實(shí)現(xiàn)高效雙特異性抗體的生產(chǎn)(圖1)。這一全面的解決方案匯集了強(qiáng)大的CHOSOURCE平臺(tái)上谷氨酰胺合成酶敲除 (GS KO) 的CHO細(xì)胞和ADCC+宿主細(xì)胞系轉(zhuǎn)座子載體技術(shù)，用于目標(biāo)分子完整高效的基因組整合，顯著優(yōu)化細(xì)胞系開發(fā) (CLD) 流程，提升雙抗的表達(dá)和配對(duì)。此外，瑞孚迪的微流控毛細(xì)管電泳分析系統(tǒng)LabChip®GXII Touch™實(shí)現(xiàn)了快速的蛋白關(guān)鍵質(zhì)量屬性分析(純度，糖型，電荷異構(gòu)性等)，將質(zhì)量分析納入生物治療工作流程早期，從而顯著提高細(xì)胞株構(gòu)建 (CLD) 效率和質(zhì)量控制。

圖1：CHOSOURCE蛋白平臺(tái)和CHOSOURCE 轉(zhuǎn)座子技術(shù). 轉(zhuǎn)座子技術(shù)是一個(gè)由轉(zhuǎn)座子載體和轉(zhuǎn)座酶mRNA組成的雙組分系統(tǒng)。轉(zhuǎn)座子載體本身含2個(gè)表達(dá)盒。目標(biāo)基因(GOIs)克隆至載體后，轉(zhuǎn)座酶通過識(shí)別載體上的末端反向重復(fù)序列(TIR)，將含有GOIs(包括GS選擇盒)的序列整合到宿主細(xì)胞基因組中，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的高效完整整合。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

不對(duì)稱4鏈雙特異性抗體，由兩條輕鏈(LC1和LC2)和兩條重鏈(HC1和HC2)組成，采用knobs-into-holes結(jié)構(gòu)(圖2)。CHOSOURCE 轉(zhuǎn)座子技術(shù)由雙表達(dá)盒轉(zhuǎn)座子載體和轉(zhuǎn)座酶兩部分組成，因4鏈分子的表達(dá)需要2個(gè)載體，通過四條序列在2個(gè)載體上的不同配組得到8種載體和組合(圖3)，兩載體間以1:1比例同轉(zhuǎn)座酶mRNA共轉(zhuǎn)染至GS KO CHO宿主細(xì)胞中。

圖2：使用CHOSOURCE 轉(zhuǎn)座子技術(shù)表達(dá)具有knobs-into-holes Fc區(qū)域的不對(duì)稱4-鏈雙特異性抗體[A]。正確的異二聚體抗體[A]會(huì)與一些不正確的鏈組合和自由鏈[B]共同表達(dá)，雜質(zhì)種類復(fù)雜。

Vector1:MCS1-HC1,MCS2-LC1;Vector2:MCS1-HC2,MCS2-LC2

Vector1:MCS1-HC1,MCS2-LC1;Vector2:MCS1-LC2,MCS2-HC2

Vector1:MCS1-LC1,MCS2-HC1;Vector2:MCS1-HC2,MCS2-LC2

Vector1:MCS1-LC1,MCS2-HC1;Vector2:MCS1-LC2,MCS2-HC2

Vector1:MCS1-HC1,MCS2-LC2;Vector2:MCS1-HC2,MCS2-LC1

Vector1:MCS1-HC1,MCS2-LC2;Vector2:MCS1-LC1,MCS2-HC2

Vector1:MCS1-LC2,MCS2-HC1;Vector2:MCS1-HC2,MCS2-LC1

Vector1:MCS1-LC2,MCS2-HC1;Vector2:MCS1-LC1,MCS2-HC2

圖3：使用 CHOSOURCE 載體表達(dá)4鏈雙特異性抗體，兩個(gè)轉(zhuǎn)座子載體與轉(zhuǎn)座酶mRNA共轉(zhuǎn)染GS KO的CHO 細(xì)胞。圖示本測(cè)試中構(gòu)建的8個(gè)不同的載體，8種不同轉(zhuǎn)染組合下的各載體的配組情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

細(xì)胞池篩選恢復(fù)和整合拷貝數(shù)分析

轉(zhuǎn)染后無需選擇劑甲硫氨酸亞砜亞胺(MSX)，6個(gè)組合的細(xì)胞池在8~13天完成篩選恢復(fù)，2個(gè)恢復(fù)慢的組合在16天達(dá)到培養(yǎng)階段(圖4)?；謴?fù)時(shí)間的差距表明每個(gè)載體內(nèi)的抗體鏈位置對(duì)細(xì)胞池的選擇恢復(fù)有影響，這可能是由于不同位置的抗體鏈的表達(dá)水平不同。

圖4：共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞池的選擇恢復(fù)概況。圖(A)代表活細(xì)胞密度，圖(B)代表活力百分比。誤差線代表兩個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)染細(xì)胞池的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

評(píng)估每個(gè)細(xì)胞池中載體的整合情況(圖5)，我們發(fā)現(xiàn)同一表達(dá)載體中的HC和LC及GS基因以1:1:1的比例整合到每個(gè)細(xì)胞池中。例如，在共轉(zhuǎn)染條件3中，載體1中LC1和HC1確定的拷貝數(shù)均為15，載體2中HC2和LC2確定的拷貝數(shù)為11，它們組合起來與觀察到的GS基因的26個(gè)拷貝相匹配。8個(gè)pool中GS 基因拷貝數(shù)基本等于兩個(gè)重鏈或輕鏈的所在載體拷貝數(shù)之和，同以往的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，說明了轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)完整的轉(zhuǎn)座。

圖5：目標(biāo)基因拷貝數(shù)插入情況。篩選恢復(fù)后每個(gè)共轉(zhuǎn)染組合條件下細(xì)胞池中四條目標(biāo)抗體序列(LC1、HC1、LC2、HC2)和篩選基因GS的插入拷貝數(shù)檢測(cè) (ddPCR方法，每個(gè)樣本三次重復(fù))。

由于兩載體以1:1的比例共轉(zhuǎn)染，預(yù)計(jì)每個(gè)庫(kù)中會(huì)整合相同數(shù)量的四個(gè)鏈拷貝。結(jié)果顯示：共轉(zhuǎn)染條件4、7和8下，所有四個(gè)鏈的數(shù)量幾乎相等；在其他條件下，并非以1:1的比例進(jìn)行。例如，在共轉(zhuǎn)染條件1中，含有“knobs”HC (HC2) 的載體比含有“holes”HC (HC1) 的載體整合更少的拷貝數(shù)(大約一半)。這可能是由于較高的“旋鈕”HC整合可能會(huì)導(dǎo)致“旋鈕-旋鈕”同二聚體的產(chǎn)生增加，這些二聚體會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

細(xì)胞池生產(chǎn)力和質(zhì)量評(píng)估

恢復(fù)后的8組測(cè)試細(xì)胞池經(jīng)14天的未優(yōu)化的fed-batch培養(yǎng)，初步評(píng)估哪個(gè)組合配置產(chǎn)能有優(yōu)勢(shì)。雙抗的產(chǎn)量數(shù)據(jù)顯示：具有相似拷貝數(shù)的六個(gè)共轉(zhuǎn)染池的抗體產(chǎn)量在相同范圍內(nèi)，并且高于1g/L，而其余兩個(gè)池拷貝數(shù)最少，產(chǎn)量也較低(圖6)。“LC1HC1_HC2LC2”(共轉(zhuǎn)染條件3)配置具有最高數(shù)量的整合拷貝，產(chǎn)生了最高的總體抗體滴度。

圖6：八個(gè)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞池的雙抗生產(chǎn)力初步評(píng)估（14天fed-batch培養(yǎng)）。

使用微流控毛細(xì)管電泳LabChip GXII Touch HT系統(tǒng)，利用ProteinEXact試劑盒進(jìn)行八組載體配置下純化抗體的非還原和還原電泳分析，并與參考雙特異性抗體進(jìn)行比較(圖7，圖8)。微流控毛細(xì)管電泳技術(shù)可以可以根據(jù)蛋白質(zhì)的大小，高效分離非還原樣品的不同構(gòu)象，如異二聚體、同二聚體、糖基化和非糖基化變體以及游離鏈等，對(duì)于分析還原樣品，可以實(shí)現(xiàn)單個(gè)抗體鏈的鑒定和定量。

比較八個(gè)載體配置下蛋白電泳圖譜發(fā)現(xiàn)（圖7），雖然“LC1HC1_HC2LC2”(共轉(zhuǎn)染條件3)具有最高的抗體滴度，但表達(dá)的抗體譜與參考分子不同。共轉(zhuǎn)染生成該池的兩個(gè)載體內(nèi)兩條重鏈和輕鏈的前后位置導(dǎo)致LC2鏈表達(dá)減少，這可能妨礙了分子的正確組裝。結(jié)合還原蛋白電泳圖譜，“LC2HC1_LC1HC2”(共轉(zhuǎn)染條件8)顯示出更多優(yōu)勢(shì)，不僅峰型與對(duì)照分子相近，四個(gè)抗體鏈的存在比例與參考分子的比例也非常相似。

圖7：LabChip GXII Touch HT系統(tǒng)評(píng)估8個(gè)配組組合及參考雙抗的非還原和還原狀態(tài)下蛋白的μCE-SDS情況。非還原蛋白樣品的電泳圖譜如[A]所示。還原蛋白樣品的電泳圖譜見[B]圖，條形圖代表各條鏈的濃度百分比(%)。

細(xì)致分析“LC2HC1_LC1HC2”(共轉(zhuǎn)染條件8)產(chǎn)生的抗體異構(gòu)體與參比分子的異同（圖8），雖然其表達(dá)滴度比條件3稍低(1.2g/Lvs1.4g/L)，但構(gòu)象正確率達(dá)到94%。產(chǎn)量和質(zhì)量評(píng)估對(duì)于確定細(xì)胞系開發(fā)流程中最佳細(xì)胞池同樣重要。

圖8：對(duì)于LC2HC1_LC1HC2(共轉(zhuǎn)染條件8)樣本抗體，微流控毛細(xì)管電泳中的各個(gè)峰相對(duì)于參考雙抗分子的細(xì)分分析。[A，B]非還原蛋白質(zhì)的各峰比較，[C，D]還原蛋白的各峰比較。

本研究只是測(cè)定了兩種載體以1:1的共轉(zhuǎn)染比例產(chǎn)生的正確抗體構(gòu)型的情況，由于雙特異性抗體的基因組整合和表達(dá)的動(dòng)力學(xué)的復(fù)雜性，兩個(gè)載體還可以嘗試以不同的比例共轉(zhuǎn)染以產(chǎn)生更佳的正確的異二聚體配置。

結(jié)論

在這項(xiàng)工作中，我們使用CHOSOURCE 轉(zhuǎn)座子載體技術(shù)表達(dá)不對(duì)稱4鏈雙特異性抗體。獲得高表達(dá)且正確的異二聚體構(gòu)象是雙抗生產(chǎn)的目標(biāo)。CHOSOURCE 轉(zhuǎn)座子技術(shù)雙盒載體提供了調(diào)節(jié)雙特異性抗體不同鏈表達(dá)的靈活性。這不僅可以通過測(cè)試兩個(gè)載體不同比例的共轉(zhuǎn)染來實(shí)現(xiàn)，還可以通過測(cè)試不同的鏈位置來實(shí)現(xiàn)。CHOSOURCE 轉(zhuǎn)座子技術(shù)搭載GS KO細(xì)胞系，能夠在轉(zhuǎn)染后約6周內(nèi)評(píng)估細(xì)胞池階段的蛋白質(zhì)質(zhì)量，鑒于轉(zhuǎn)座子帶來的完整高效整合，有助于高效實(shí)現(xiàn)CLD的開發(fā)。

雙特異性抗體分子設(shè)計(jì)的進(jìn)步，例如knobs-into-holes結(jié)構(gòu)，顯著減少了錯(cuò)配和同源二聚體污染。然而，“孔-孔”同二聚體和共純化的游離鏈仍然存在挑戰(zhàn)，故在細(xì)胞系開發(fā)過程的早期納入質(zhì)量分析變得很關(guān)鍵。瑞孚迪的微流控毛細(xì)管電泳LabChip GXII Touch HT系統(tǒng)可用于進(jìn)一步提高生物制劑開發(fā)的速度。在本研究中，LabChip GXII Touch HT系統(tǒng)可以快速檢測(cè)細(xì)胞池表達(dá)的抗體表征。將非還原和還原的抗體圖譜與參考分子進(jìn)行直接比較，能夠在細(xì)胞系開發(fā)時(shí)及早識(shí)別最佳的細(xì)胞池。

總之，瑞孚迪的CHOSOURCE表達(dá)平臺(tái)和LabChip GXII Touch HT系統(tǒng)的強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)手，可以大程度的簡(jiǎn)化和加速?gòu)?fù)雜分子的細(xì)胞系開發(fā)過程，促進(jìn)生物治療藥物的開發(fā)和進(jìn)步。