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抗體因其多種作用機(jī)制而成為天然的有效治療藥物。其中一種關(guān)鍵機(jī)制是受體介導(dǎo)的內(nèi)化。鑒于抗體與抗原結(jié)合的高度特異性，與藥物、毒素或酶偶聯(lián)的抗體可以作為具有特異性的細(xì)胞毒性遞送劑，在治療效果，減少非靶向效應(yīng)[1]。有效的治療性抗體偶聯(lián)藥物（ADC）不僅需要對腫瘤抗原具有特異性結(jié)合能力，還需要內(nèi)化有效載荷（payload）以發(fā)揮細(xì)胞毒性效應(yīng)。ADC療法開發(fā)更為復(fù)雜，涉及多個步驟，包括識別靶抗原、發(fā)現(xiàn)理想抗體、選擇細(xì)胞毒性有效載荷和連接子（linker），以及優(yōu)化偶聯(lián)化學(xué)——所有這些步驟從最初研究到治療應(yīng)用可能需要數(shù)年時間[2,3]。在這個過程中，一個顯著的瓶頸是缺乏早期階段的檢測方法來指導(dǎo)從數(shù)百個抗原結(jié)合克隆中篩選出功能性抗體[4]。

抗體內(nèi)化可能很復(fù)雜且高度可變，這取決于許多相互作用的因素，包括抗體-靶標(biāo)親和力、表位可及性、細(xì)胞類型、靶蛋白表達(dá)程度、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)等[5,6]。盡管流式細(xì)胞術(shù)、共聚焦顯微鏡和高內(nèi)涵成像等廣泛使用的方法對為研究抗體內(nèi)化提供可靠方法，但它們在篩選大型抗體庫時受到復(fù)雜檢測操作、通量有限和相對較高成本等限制。鑒于這些挑戰(zhàn)，一個用于在早期發(fā)現(xiàn)階段識別抗體內(nèi)化的高通量檢測將極大地加速ADC的開發(fā)[6]。

布魯克細(xì)胞分析（Bruker Cellular Analysis）提供了先進(jìn)的抗體發(fā)現(xiàn)解決方案，使客戶能夠在一周內(nèi)篩選到有價值的單克隆抗體（圖1）。我們的方法注重初始階段的功能性篩選，而不是產(chǎn)生一系列抗原結(jié)合hits后進(jìn)行繁瑣、昂貴且相對小規(guī)模的功能性分析。使用Beacon®單細(xì)胞功能表征平臺，可以在一天內(nèi)利用光電定位（OEP）技術(shù)分離數(shù)萬個單細(xì)胞，再使用微珠和報告細(xì)胞檢測抗體分泌、抗原結(jié)合和受體特異性內(nèi)化（圖1）。

以雜交瘤細(xì)胞系為模型，本應(yīng)用說明展示了簡化早期發(fā)現(xiàn)階段內(nèi)化抗體發(fā)現(xiàn)的新能力，超越了抗原特異性，實現(xiàn)了高通量、實時評估功能性抗體。我們的解決方案簡化了篩選過程，使研究人員能夠在發(fā)現(xiàn)階段早期快速篩選、識別并戰(zhàn)略性地導(dǎo)出具有最佳內(nèi)吞特性的抗體。這種能力使得下游表征和優(yōu)化能夠集中在最有希望的候選抗體上，最終加速理想抗體進(jìn)入臨床應(yīng)用的進(jìn)程。

圖1 | Opto® B Discovery工作流程能夠在一周內(nèi)實現(xiàn)B細(xì)胞分離、激活、自動化單細(xì)胞分離、高通量功能篩選以及單克隆抗體序列回收。

受體特異性內(nèi)化的模型系統(tǒng)開發(fā)

作為模型系統(tǒng)，本初步研究使用了兩種小鼠雜交瘤細(xì)胞，OKT8（CRL-8014）和OKT3（CRL-8001），它們分別表達(dá)針對人CD8和CD3的單克隆抗體（圖2A）。此外，將JurkatCD3+/CD8-細(xì)胞作為陽性對照，RajiCD3-/CD8-細(xì)胞作為陰性對照，以證明受體特異性內(nèi)化（圖2B）。在芯片上的檢測之前，我們通過芯片外的內(nèi)化檢測首先驗證這些表達(dá)譜，其中報告細(xì)胞與等濃度的熒光標(biāo)記的抗CD3或抗CD8抗體一起孵育。在與抗CD3抗體一起孵育的Jurkat細(xì)胞中觀察到了抗體內(nèi)化，但與抗CD8抗體一起孵育時則沒有觀察到（圖2C）。相比之下，兩種抗體在Raji細(xì)胞系中均未顯示出內(nèi)化（圖2D）。

圖2 | A) 利用雜交瘤OKT3和OKT8細(xì)胞系作為模型系統(tǒng)進(jìn)行抗體內(nèi)化實驗開發(fā)，這兩種細(xì)胞系分別表達(dá)單克隆抗CD3（藍(lán)色）和抗CD8（灰色）抗體。B) JurkatCD3+/CD8-和RajiCD3-/CD8-細(xì)胞系被用作陽性與陰性對照，以展示受體特異性內(nèi)化。C) JurkatCD3+/CD8-細(xì)胞系與D) RajiCD3-/CD8-細(xì)胞系在96孔板中與熒光標(biāo)記的抗CD3或抗CD8共孵育后，所拍攝的20X倍率的落射熒光圖像。

芯片上用于篩選內(nèi)化抗體的Assay設(shè)計

將抗體分泌的OKT3和OKT8細(xì)胞系的細(xì)胞懸浮液依次導(dǎo)入Beacon®系統(tǒng)上的OptoSelect®芯片的通道中。利用光電定位（OEP）技術(shù)在NanoPen®小室內(nèi)進(jìn)行單細(xì)胞分離后，細(xì)胞被培養(yǎng)并利用基于微珠和細(xì)胞的檢測方法篩選抗體分泌和受體特異性內(nèi)化。我們首先利用包被有小鼠特異性抗IgG抗體的檢測微珠篩選抗體分泌，這些微珠懸浮在含有熒光標(biāo)記二抗的培養(yǎng)基中（圖3A）。將含有檢測珠子的培養(yǎng)基導(dǎo)入OptoSelect®芯片的通道中，微珠直接在分泌細(xì)胞上方捕獲抗體，導(dǎo)致二抗的熒光聚集（圖3B和C）。

圖 3 | A）用于檢測抗體分泌的基于珠子的捕獲檢測試劑結(jié)合了anti-IgG偶聯(lián)珠子和熒光團(tuán)標(biāo)記的二抗。B）將檢測試劑導(dǎo)入到OptoSelect®通道中，C）通過延時成像來觀察IgG分泌（綠色）。

為了快速篩選內(nèi)化抗體，我們選擇了一種快速且易于使用的pH敏感標(biāo)記試劑。Invitrogen™ Zenon™ pHrodo™ Deep Red IgG Labeling Reagent（Z25622）是一種與pH敏感熒光團(tuán)結(jié)合的Fc特異性多克隆Fab片段。在中性pH下幾乎不觀察到熒光，只有當(dāng)它位于酸性的晚期內(nèi)體或者溶酶體腔室時，熒光團(tuán)才會變得明亮（圖4A）。這種在細(xì)胞外的微弱熒光信號對于在Beacon®上進(jìn)行快速、無需洗滌的檢測非常有利。對于芯片上的檢測，將表達(dá)感興趣靶抗原的報告細(xì)胞懸浮在含有pH敏感內(nèi)化試劑的培養(yǎng)基中，并導(dǎo)入OptoSelect®芯片（圖4B）。從分離的細(xì)胞中分泌的抗體被內(nèi)化試劑識別；然而，只有當(dāng)抗體與報告細(xì)胞上的靶受體結(jié)合并內(nèi)化時，熒光才會增強(qiáng)（圖4C，Pen A）。不與靶受體結(jié)合的非特異性抗體不會被內(nèi)化，將導(dǎo)致檢測結(jié)果為陰性（圖4C，Pen B）。

圖4 | A）對于基于細(xì)胞的抗體內(nèi)化檢測，表達(dá)目標(biāo)受體的報告細(xì)胞系被懸浮在含有內(nèi)化試劑的培養(yǎng)基中。該內(nèi)化試劑是一種與pH敏感熒光團(tuán)偶聯(lián)的抗IgG Fc特異性Fab片段，在堿性pH下熒光較弱，但在酸性條件下會變得明亮熒光。當(dāng)分泌的抗體-Fab復(fù)合物通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞時，隨著其被運(yùn)輸?shù)剿嵝詢?nèi)體/溶酶體腔室，熒光會急劇增加。B）細(xì)胞和pH敏感的Fab試劑被導(dǎo)入到OptoSelect®通道中，C）通過延時成像來觀察熒光的變化，從而指示抗體內(nèi)化。圖中（C）部分的彩虹“雷達(dá)"線有助于說明熒光擴(kuò)散隨時間的擴(kuò)展。Pen A和Pen B來自圖3中展示的同一實驗。

芯片上的受體特異性抗體內(nèi)化

鑒于本研究中模型細(xì)胞系的高抗體分泌率，我們在OptoSelect® 3500芯片的每四個NanoPen®小室中僅加載一個OKT3或OKT8細(xì)胞，以確保清晰的檢測讀數(shù)；得到的模式是在每種細(xì)胞類型之間留出一個空的小室（圖5A）。為了方便起見，我們在芯片上對細(xì)胞進(jìn)行過夜培養(yǎng)，并在第二天進(jìn)行檢測；也可以在同一天加載和檢測細(xì)胞。利用之前描述的基于微珠的檢測評估抗體分泌，識別兩種雜交瘤細(xì)胞系陽性IgG “blooming"（圖 5A）。

在IgG分泌檢測之后，我們立即使用芯片內(nèi)的基于細(xì)胞的檢測來分析抗體內(nèi)化。為了保持報告細(xì)胞的活性并避免培養(yǎng)基酸化，JurkatCD3+/CD8-或RajiCD3-/CD8-細(xì)胞在導(dǎo)入前新鮮制備。將細(xì)胞以最佳密度懸浮在含有內(nèi)化試劑的培養(yǎng)基中，以填滿通道區(qū)域（圖5B和C）。利用Cell Analysis Suite（CAS®）軟件中的Capture Assay操作，每隔10分鐘獲取一次熒光圖像，持續(xù)1至2小時。預(yù)期能夠與靶抗原結(jié)合并在內(nèi)化進(jìn)入報告細(xì)胞的分泌抗體（分泌anti-CD3的OKT3雜交瘤細(xì)胞）會在NanoPen®小室上方產(chǎn)生增強(qiáng)的熒光（圖5B）。不被報告細(xì)胞識別或者能夠結(jié)合但不內(nèi)化的抗體，將不被判斷為陽性（圖5C）。經(jīng)過Image Analyzer軟件的分析，98.4%分泌抗CD3的OKT3雜交瘤細(xì)胞在JurkatCD3+/CD8-報告細(xì)胞中顯示出陽性內(nèi)化信號（圖 5D）。僅有1個NanoPen小室（0.74%）包含分泌抗CD8的OKT8細(xì)胞被標(biāo)記為陽性（圖5D）。經(jīng)過進(jìn)一步評估，這個小室很可能是由于報告細(xì)胞漂移導(dǎo)致的假陽性。作為陰性對照，使用不表達(dá)CD3或CD8的RajiCD3-/CD8-報告細(xì)胞重復(fù)內(nèi)化檢測，對于兩種雜交瘤都沒有得到內(nèi)化陽性結(jié)果（圖5C和D）。

圖 5 | 三個連續(xù)檢測的代表性圖像。A）來自分泌細(xì)胞（白色字體標(biāo)示的Pen內(nèi)）的IgG抗體被通道內(nèi)的珠子捕獲，導(dǎo)致熒光信號（綠色）增強(qiáng)。使用與pH敏感的pHrodo染料偶聯(lián)的抗小鼠Fc特異性Fab片段來檢測受體特異性內(nèi)化，B）使用JurkatCD3+/CD8- 細(xì)胞，C）使用RajiCD3-/CD8-細(xì)胞。當(dāng)抗體-Fab復(fù)合物被內(nèi)化并隔離到酸性內(nèi)體/溶酶體腔室時，可觀察到內(nèi)化試劑的熒光（品紅色，pHrodo）（B中的 OKT3 細(xì)胞）。D）在 Jurkat 和 Raji 細(xì)胞中對抗體內(nèi)化呈陽性的IgG陽性雜交瘤細(xì)胞的定量。

報告細(xì)胞系選擇

盡管本文未深入討論，但選擇合適的報告細(xì)胞系對于開發(fā)和成功進(jìn)行基于細(xì)胞的檢測至關(guān)重要。然而由于抗體發(fā)現(xiàn)要求的多樣性和報告細(xì)胞系表達(dá)抗原的差異性，不存在通用解決方案。在執(zhí)行芯片檢測之前評估抗原表達(dá)水平和在整個細(xì)胞群體內(nèi)的均勻表達(dá)至關(guān)重要。抗原表達(dá)水平低將導(dǎo)致芯片上熒光“blooming"強(qiáng)度低而難以檢測，表達(dá)水平高度不均勻則可能會導(dǎo)致假陰性結(jié)果。此外，還需要考慮的因素包括細(xì)胞導(dǎo)入密度、細(xì)胞健康狀況、添加避免聚集的物質(zhì)以及對于貼壁細(xì)胞系可能需要的解離步驟。

基于細(xì)胞的檢測注意事項和展望

本文描述的抗體內(nèi)化檢測極大地擴(kuò)展了Beacon®平臺的能力，使其能夠快速、高通量地評估抗體功能。盡管這項工作是高通量量化抗體內(nèi)化的一個開創(chuàng)性的嘗試，但當(dāng)前工作流程存在一些局限性。它允許對抗體內(nèi)化進(jìn)行二元識別；然而，我們尚未證明是否可以用此方法對內(nèi)化速率或效率進(jìn)行排名。此外，目前在未經(jīng)過大量驗證和軟件優(yōu)化之前，我們建議使用Image Analyzer軟件進(jìn)行手動分析。我們還注意到，鑒于需要長時間（>1小時）來觀察內(nèi)化，報告細(xì)胞在OptoSelect®芯片通道內(nèi)的小流體漂移可能會改變看似檢測結(jié)果，因此，我們發(fā)現(xiàn)手動查看時間序列圖像，能夠更準(zhǔn)確地識別檢測陽性。本文描述的內(nèi)化檢測展示了在開發(fā)早期識別有前景的抗體的能力上的重大進(jìn)步。此外，它為更全面的檢測和分析奠定了基礎(chǔ)，包括評估內(nèi)化的程度和速率等。在早期發(fā)現(xiàn)階段以規(guī)模識別有利的抗體候選物將顯著推進(jìn)ADC的開發(fā)。

結(jié) 論

Bruker Cellular Analysis提供的Opto® B Discovery工作流程解決方案能夠在一天內(nèi)識別出數(shù)千個抗原特異性抗體hits，不僅簡化了抗體發(fā)現(xiàn)過程，而且顯著快于傳統(tǒng)發(fā)現(xiàn)方法。研究人員利用Beacon®系列單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)不僅可以識別具有抗原特異性結(jié)合能力的抗體，還能夠運(yùn)行連續(xù)檢測來評估親和力、阻斷、內(nèi)吞特性等在內(nèi)的抗體功能特性。這種在發(fā)現(xiàn)階段早期識別具有所需靶標(biāo)特異性屬性的候選物將極大地加速篩選過程，推進(jìn)最佳候選抗體進(jìn)入臨床試驗。