01

 為什么DH5α生長速度慢/長斑小？

原因：

（1）DH5α感受態(tài)細(xì)胞生長速度較慢；

（2）涂板菌液太多，菌落過多，導(dǎo)致菌落生長速度慢/菌落小。

方案：

（1）延長菌的生長時(shí)間；

（2）建議減少菌液涂布量，剩下的菌液可放4℃保存，看菌的生長狀況再?zèng)Q定去留。

02

DH5α和DH5α-的區(qū)別是什么？

DH5α需要IPTG和X-Gal共同使用進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。

DH5α-無需加入IPTG，只需X-Gal即可進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。

03

Mach1T1和Turbo哪個(gè)生長速度快？

Turbo

04

細(xì)菌怎么實(shí)現(xiàn)抗噬菌體的特點(diǎn)？

（1）抑制吸附：改變細(xì)菌表面的受體蛋白結(jié)構(gòu)，受體缺失，競爭性抑制產(chǎn)物的作用等；

（2）阻止噬菌體DNA的注入；

（3）降解或干擾噬菌體DNA；

（4）流產(chǎn)感染。

05

DB3.1細(xì)胞是怎樣實(shí)現(xiàn)含有ccdB基因在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增的？

ccdB蛋白的毒性作用是通過與促旋酶GyrA亞基第462位氨基酸相結(jié)合使得DNA斷裂后不能進(jìn)行修復(fù)，DNA合成受阻，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

DB3.1菌株的細(xì)胞含有g(shù)yrA462基因，能夠表達(dá)GyrA亞基蛋白與ccdB結(jié)合的區(qū)域，可以競爭性抑制ccdB蛋白的活性，使得促旋酶可以正常行使功能，實(shí)現(xiàn)含有ccdB的載體的正常擴(kuò)增。

06

 從JM110細(xì)胞制備的質(zhì)粒可以用于基于Dpn I消化的點(diǎn)突變?cè)噭┖袉幔?/span>

不能。JM110是甲基化基因dam，dcm缺失突變株，在其內(nèi)擴(kuò)增的質(zhì)粒無法進(jìn)行甲基化，而點(diǎn)突變?cè)噭┖兄械腄pnⅠ的作用是消化甲基化的模板質(zhì)粒。

注：

（1）基于DpnⅠ消化的點(diǎn)突試劑盒是以甲基化的載體質(zhì)粒作為模板，設(shè)計(jì)一對(duì)點(diǎn)突引物進(jìn)行擴(kuò)增；

（2）使用DpnⅠ消化甲基化的模板質(zhì)粒；

（3）PCR擴(kuò)增的片段沒有甲基化，因此不能被DpnⅠ消化降解；

（4）將DpnⅠ消化后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞。

07

大腸桿菌質(zhì)粒甲基化有哪幾類？通過何種方法可以去甲基化？何種方法來驗(yàn)證質(zhì)粒已經(jīng)去甲基化？JM110可以用于大量質(zhì)粒制備嗎？

2種，Dam，Dcm（Dam甲基化酶可將GATC序列中的腺嘌呤N6位點(diǎn)進(jìn)行甲基化修飾，Dcm甲基化酶可將CCAGG和CCTGG序列中胞嘧啶C5位點(diǎn)進(jìn)行甲基化修飾）。  

可以將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入JM110感受態(tài)細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒的去甲基化。

可以使用XbaⅠ酶切的方法驗(yàn)證質(zhì)粒是否去甲基化。

不可以，JM110感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率低，并且它不能使質(zhì)粒甲基化，容易引起突變。

08

stbl3和stbl4的區(qū)別（菌株是從哪家公司來的）？適用于哪種類型的質(zhì)粒構(gòu)建？

區(qū)別：（Stbl3和Stbl4菌株是從invitrogen公司來的）Stbl3為鏈霉素抗性菌株，Stbl4是四環(huán)素抗性菌株。Stbl4較Stbl3生長較慢。

適用于逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建，即帶有5’-LTR和3’-LTR結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒，如pLV-Flag質(zhì)粒。

09

藍(lán)白斑篩選原理是什么？

（1）藍(lán)白斑篩選的條件是具有LacZα編碼區(qū)的載體與可以進(jìn)行α-互補(bǔ)的宿主細(xì)胞（如Mach1-T1、*0、DH5α、JM109、DH10B和NEB10-beta等）配合使用；

（2）一些載體具有LacZα基因編碼區(qū)，可以編碼LacZ蛋白N端的α片段（此編碼區(qū)中含有多克隆位點(diǎn)，允許外源基因的插入）。其宿主細(xì)胞是一種僅可以編碼LacZ蛋白C端ω區(qū)域的細(xì)胞，載體和宿主單獨(dú)產(chǎn)生的LacZ片段并沒有β-半乳糖苷酶活性；

（3）當(dāng)載體進(jìn)入宿主細(xì)胞時(shí)，載體的α片段和宿主的ω片段實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ)，由α-互補(bǔ)產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶具有活性，在IPTG和X-Gal的存在下，菌落變?yōu)樗{(lán)色；

（4）但是當(dāng)外源基因插入到在載體LacZα編碼區(qū)中，破壞了LacZ基因α片段的正常表達(dá)，使得其與宿主細(xì)胞不能進(jìn)行α-互補(bǔ)，因此在IPTG和X-Gal的存在下，菌落為白色。

10

DH10B和DH10Bac有何區(qū)別？

DH10B是一種可以用來進(jìn)行大質(zhì)粒（>8 kb）轉(zhuǎn)化的克隆感受態(tài)細(xì)胞。

DH10Bac是一種用于昆蟲桿狀病毒Bac-to-Bac系統(tǒng)中同源重組所用的菌株，其可用于pFastBac系列質(zhì)粒（如pFastBacl和pFastBacDual）的轉(zhuǎn)化。其感受態(tài)細(xì)胞中含有用于pFastBac系列質(zhì)粒重組的Bacmid和輔助質(zhì)粒。

11

BL21 和BL21(DE3)的區(qū)別是什么，DE3代表什么基因？

BL21(DE3)是在BL21菌株的基因組上整合了T7 RNA聚合酶基因，適合于T7系統(tǒng)的表達(dá)（具有T7 promoter）。

DE3是一段可以表達(dá)T7 RNA聚合酶的序列，通過溶原性噬菌體將序列整合到細(xì)菌基因組中。

12

 BL21(DE3)和T7 express表達(dá)菌有什么區(qū)別？

T7 express表達(dá)菌株來源于BL21菌株，T7 express與BL21(DE3)的主要區(qū)別在于T7 express菌株的T7 RNA聚合酶基因整合在菌株基因組中的Lac操縱子區(qū)域，并具有抗T1噬菌體感染的特點(diǎn)。BL21（DE3）菌株中的T7 RNA聚合酶基因來源于噬菌體溶原方法，存在噬菌體成分。

13

表達(dá)含有稀有密碼子的基因需要選擇哪類感受態(tài)細(xì)胞，這類細(xì)胞實(shí)現(xiàn)表達(dá)的原理是什么?

Rosetta（DE3）

Rosetta（DE3）具有一個(gè)帶有氯霉素抗性的質(zhì)粒，可以補(bǔ)充6種稀有密碼子的tRNA（精氨酸 Arg R: AGA  AGG，異亮氨酸 Ile I: AUA， 脯氨酸 Pro P CCC， 亮氨酸Leu  L：CUA，甘氨酸 Gly G:GGA）。

14

使用BL21(DE3)細(xì)胞進(jìn)行蛋白表達(dá)時(shí)，細(xì)胞一誘導(dǎo)就死，請(qǐng)問用什么方法解決？

可以使用BL21（DE3）pLysS 或T7pLysY表達(dá)菌株。

15

pLysY和pLysS有什么區(qū)別？

pLysY表達(dá)的T7溶菌酶保留了對(duì)T7RNA聚合酶的抑制作用，但是缺失了水解細(xì)胞壁的酰胺酶活性，避免了誘導(dǎo)過程中細(xì)胞的裂解。

pLysS表達(dá)的T7溶菌酶具有完整活性。

16

 含有二硫鍵的蛋白請(qǐng)問用何種感受態(tài)細(xì)胞比較好？

OrigamiB（DE3）或Shuffle T7-K12，Shuffle T7-B。

17

增加表達(dá)蛋白的可溶性表達(dá)采用何種感受態(tài)細(xì)胞？

OrigamiB（DE3）或Shuffle T7-K12，Shuffle T7-B。

18

使用OrigamiB（DE3）感受態(tài)細(xì)胞時(shí)應(yīng)該注意什么？

OrigamiB（DE3）感受態(tài)細(xì)胞具有卡那霉素和四環(huán)素抗性，所以轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒不能是卡那霉素抗性或四環(huán)素抗性的。

19

說明書上寫這XL10-Gold細(xì)胞具有四環(huán)素和氯霉素抗性，我的質(zhì)粒是氨芐青霉素抗性，請(qǐng)問轉(zhuǎn)化這個(gè)質(zhì)粒時(shí)，需要加四環(huán)素和氯霉素抗生素嗎？

不用，四環(huán)素和氯霉素是在菌株的基因組中穩(wěn)定存在的，不用加這兩種抗生素。

20

下面的抗生素如何配制，工作濃度是多少？

配置方法：通常抗生素是以工作濃度1000倍的濃度儲(chǔ)存的。以配置10ml的Amp為例，首先稱取1 g粉末狀的氨芐抗生素藥品，裝入15 ml EP管中，使用ddH2O溶解并定容到10 ml，搖晃使其*溶解后，使用0.22 μm的過濾器過濾除菌，分裝到1.5 ml EP管中保存使用。

21

Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞的工作原理是什么？

Rosetta（DE3）具有一個(gè)帶有氯霉素抗性的質(zhì)粒，可以補(bǔ)充6種稀有密碼子的tRNA（精氨酸 Arg R: AGA  AGG，異亮氨酸 Ile I: AUA， 脯氨酸 Pro P CCC， 亮氨酸Leu  L：CUA，甘氨酸 Gly G:GGA）。

22

轉(zhuǎn)化效率可達(dá)10⁸ cfu/μg，是什么意思？如何測定轉(zhuǎn)化效率？

指的是每微克超螺旋構(gòu)象的DNA即pUC19（2686 bp）經(jīng)轉(zhuǎn)化后可以得到的陽性克隆菌落的個(gè)數(shù)為10⁸個(gè)。

大腸桿菌感受態(tài)通常使用0.1 ng/μl pUC19作為測定轉(zhuǎn)化效率的質(zhì)粒，在100 μl感受態(tài)細(xì)胞中加入1 μl pUC19質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化完成后加入900ul SOC孵育1 h（此時(shí)pUC19的濃度為0.1 ng/ml），其后吸取10 μl菌液稀釋到990 μl SOC中（此時(shí)pUC19的濃度為0.001 ng/ml），吸取100 μl菌液涂在抗性板（此時(shí)pUC19的含量為0.0001 ng），37℃培養(yǎng)過夜后，數(shù)取菌落個(gè)數(shù)并計(jì)算轉(zhuǎn)化效率。假設(shè)平板生長菌落數(shù)為100個(gè)，那么轉(zhuǎn)化效率計(jì)算公式:

100 cfu/0.0001ng=1×10⁹ cfu/μg

農(nóng)桿菌感受態(tài)通常使用超螺旋構(gòu)象的100 ng/μl pCAMBIA2301（11633 bp）作為測定轉(zhuǎn)化效率的質(zhì)粒。

23

羧芐青霉素為何比氨芐青霉素在搖菌中效果要好？

細(xì)菌生長過程中培養(yǎng)基pH降低，羧芐青霉素在pH降低的情況下仍可穩(wěn)定存在，而氨芐青霉素在pH降低后不穩(wěn)定，易降解。

24

氨芐抗生素的平板上的衛(wèi)星菌落是如何產(chǎn)生的？

具有Amp抗性的細(xì)菌生長過程中會(huì)產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，并釋放到細(xì)胞外。而β-內(nèi)酰胺酶可以降解氨芐抗生素，使得菌落周圍沒有了抗性，長出衛(wèi)星菌落。

25

需要做phage display（噬菌體展示實(shí)驗(yàn)），請(qǐng)問用哪種感受態(tài)細(xì)胞？

XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞

26

分別簡單敘述一些大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞和農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化操作步驟

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化步驟：

（1）將100 μl感受態(tài)細(xì)胞放在冰上溶解；

（2）將1-10 μl的連接產(chǎn)物加入到100 μl感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈底部混勻；

（3）冰上孵育20-30 min；

（4）42℃，熱擊90 sec；

（5）迅速放到冰上孵育2 min；

（6）加入900 μl 無抗性LB，200 rpm ，37℃孵育1 h；

（7）6000 rpm離心收集菌，棄掉900 μl 上清，使用剩余的LB輕輕重懸菌液；

（8）將重懸菌液涂在相應(yīng)的抗性板上。

注：具有Amp抗性的質(zhì)粒(<8 kb)轉(zhuǎn)化后，可以不經(jīng)過孵育直接涂板。

農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化步驟：

（1）將100 μl感受態(tài)細(xì)胞放在冰上溶解；

（2）將1-10 μl的連接產(chǎn)物加入到100 μl感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈底部混勻；

（3）冰上孵育5 min，液氮5 min，37℃放置5 min，冰浴5 min；

（4）加入900 μl SOC培養(yǎng)基，28℃振蕩培養(yǎng)2-3 h；

（5）6000 rpm離心收集菌，棄掉900 μl 上清，使用剩余的SOC輕輕重懸菌液；

（6）將重懸菌液涂在相應(yīng)的抗性板上。

27

具有卡那抗性的質(zhì)粒pEGFP-N1為什么不能轉(zhuǎn)化到4種農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中？

因?yàn)閜EGFP-N1不具有農(nóng)桿菌的復(fù)制起始子，所以不能在農(nóng)桿菌中擴(kuò)增。

28

農(nóng)桿菌細(xì)胞是如何將外源基因轉(zhuǎn)移植物細(xì)胞核基因組中的？

小知識(shí)：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的雙元載體系統(tǒng)  

包含兩個(gè)不同的質(zhì)粒：一種是野生宿主源的小復(fù)制子（wide-host-range small replicon），含有一復(fù)制起始點(diǎn)（ori），能夠讓質(zhì)粒在包括大腸桿菌和農(nóng)桿菌在內(nèi)的細(xì)菌內(nèi)維持生長，這類質(zhì)粒通常含有a）替換T-DNA的外源DNA。b）T-DNA左右邊界序列（或至少含T-DNA右邊界）。c）同時(shí)維持和篩選大腸桿菌和農(nóng)桿菌的標(biāo)記基因。d）植物生長的篩選標(biāo)記基因。 一種是輔助型Ti質(zhì)粒（helper Ti plasmid），缺乏完整的T-DNA區(qū)域，但是含有完整的vir區(qū)，能夠激活T-DNA的轉(zhuǎn)移。

（1）構(gòu)建重組質(zhì)粒，將目的基因插入到T-DNA區(qū)，隨后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中；

（2）農(nóng)桿菌含有Ti 質(zhì)粒，借助Ti質(zhì)粒的功能，使插入目的基因的T-DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)宿主植物中并進(jìn)一步整合、表達(dá)。

29

LB，SOB，SOC，2×YT培養(yǎng)基的區(qū)別是什么？

LB培養(yǎng)基用于一般的細(xì)菌培養(yǎng)。

SOB培養(yǎng)基是一種富營養(yǎng)培養(yǎng)基。與LB培養(yǎng)基相比，SOB培養(yǎng)基中含有兩倍多蛋白胨，蛋白胨中富含氨基酸及多肽。另外，SOB培養(yǎng)基中含有鎂離子，鎂離子是高密度培養(yǎng)必須的離子。在SOB培養(yǎng)基中的大腸桿菌具有更高的轉(zhuǎn)化效率。
SOC培養(yǎng)基是SOB加入葡萄糖以抑制分解代謝，增加生長速度。

2×YT 培養(yǎng)基是比LB培養(yǎng)基營養(yǎng)更為豐富的培養(yǎng)基。細(xì)胞能夠生長更長的時(shí)間，濃度達(dá)到更高的值。

30

制備腺病毒選擇哪個(gè)感受態(tài)細(xì)胞？

BJ5183-AD-1或BJ5183

31

感受態(tài)細(xì)胞Shuffle T7-K12和Shuffle T7-B 感受態(tài)細(xì)胞有什么區(qū)別？

Shuffle T7-K12來源于K12菌株，可以組成型表達(dá)LacI阻遏蛋白，降低基因表達(dá)的背景，有利于毒性蛋白的表達(dá)。

Shuffle T7-B 是BL21 增強(qiáng)型菌株，適合非毒性蛋白的表達(dá)。

不同的蛋白在這兩種細(xì)胞中的可溶性差異很大，所以建議兩種都試一下。

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