禽流感病毒H5N6亞型（AIV-H5N6熒光PCR試劑盒用禽流感病毒H5N6亞型的特異性引物，分別結(jié)合一條特異性熒光探針，用一步法熒光 RT-PCR 技術(shù)對禽流感病毒H5N6亞型 RNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測， 用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷。
本試劑盒適用于檢測標(biāo)本中的禽流感病毒H5N6亞型 RNA，適用于禽流感病毒H5N6亞型感染的輔助診斷及流行病學(xué)調(diào)查，其檢測結(jié)果僅供參考。

禽流感病毒H5N6亞型(AIV-H5N6熒光PCR試劑盒說明書

【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：禽流感病毒 H5N6 亞型（AIV- H5N6）核酸檢測試劑盒(實時熒光-PCR法)

Name ：Diagnostic Kit for Avian Influenza Virus subtype H5N6 RNA (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】48T/盒

【預(yù)期用途】

本試劑盒適用于檢測標(biāo)本中的禽流感病毒 H5N6 亞型 RNA，適用于禽流感病毒 H5N6 亞型感染的輔助診斷及流行病學(xué)調(diào)查，其檢測結(jié)果僅供參考。

【檢驗原理】

本試劑盒用禽流感病毒 H5N6 亞型的特異性引物，分別結(jié)合一條特異性熒光探針，用一步法熒光 RT-PCR 技術(shù)對禽流感病毒 H5N6 亞型 RNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測， 用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷。

【試劑組成】

名 稱 規(guī) 格

酶液 50μL×1 管

AIV-H5N6 反應(yīng)液 1.0mL×1 管

AIV-H5N6 陽性質(zhì)控品 50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品 250μL ×1 管

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復(fù)凍融少于 7 次，有效期 9 個月。

【適用儀器】

ABI 7300、7500、ABI stepone / stepone plus 、安捷倫 MX3000P/3005P、MJ Opticon2、Eppendorf 2/4 Color Systems、Bio-RadCFX96、Roche Gene 6000、Roche LC480 等熒光定量 PCR 檢測儀。

【標(biāo)本采集】

病死或撲殺禽，取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織；待檢活禽，用棉拭子   取呼吸道分泌物或排泄物，置于 1mL 50%甘油生理鹽水中。

【保存和運輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標(biāo)本運送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運輸，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.05g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；棉拭子直接取 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。

1.2RNA 提取

推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的 RNA 提取試劑盒（離心柱提取法），請按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑 AIV-H5N6 反應(yīng)液 酶液

用量 20μL 1μL

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 RNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；熒光通道選擇： 檢測通道

（Reporter Dye）FAM、ROX， 淬滅通道（Quencher Dye）選擇NONE，

請勿選擇 ROX 參比熒光。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟 循環(huán)數(shù) 溫度 時間 收集熒光信號

1 1cycle 42℃ 20min 否

2 1 cycle 95℃ 10min 否

3 40 cycle 94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

FAM 通道為禽流感病毒 H5 亞型檢測結(jié)果，ROX 通道為禽流感病毒 N1 亞型檢測結(jié)果

陽性：檢測通道 Ct 值≤35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線。

可疑：檢測通道 Ct 值>35.0，且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線的樣本建議重復(fù)試驗，重復(fù)試驗結(jié)果出現(xiàn) Ct 值≤35.0 和典型擴(kuò)增曲線者為陽性，否則為陰性。

陰性：樣本檢測結(jié)果無 Ct 值且無明顯的擴(kuò)增曲線。

6.檢測方法的局限性

樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

陽性對照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

病原體在流行過程中基因突變、重組，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

不同的提取方法存在提取效率差異，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

試劑運輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果；

本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

7.質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：無明顯擴(kuò)增曲線且無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效。

【注意事項】

所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行；

試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，*混勻并短暫離心；

反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)工作服；

樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；

實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全   通則》進(jìn)行處理。

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