禽流感是由A型流感病毒所引起的禽類疾病。AIV/除了感染禽類外，部分亞型也能夠引起人感染或發(fā)病。野生水禽是禽流感病毒的自然宿主，一般對其不致病，當(dāng)它們傳染給其它物種時(shí)有時(shí)會造成大的發(fā)病率和死亡率。禽流感/新城疫病毒（AIV/NDV）熒光PCR試劑盒分別對禽流感AIV和新城疫病毒NDV設(shè)計(jì)特異性的引物和探針，用一步法熒光RT-PCR技術(shù)對AIV/NDV RNA進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測。

禽流感/新城疫病毒(AIV/NDV)熒光PCR試劑盒說明書

【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：禽流感/新城疫病毒(AIV/NDV)核酸檢測試劑盒(實(shí)時(shí)熒光-PCR法)

Name ：Avian Influenza/Newcastle Disease Virus (AIV/NDV) Nucleic Acid Detection Kit (Real-time Fluorescence-PCR)

【包裝規(guī)格】48T/盒

【預(yù)期用途】

禽流感是由A型流感病毒所引起的禽類疾病。AIV/除了感染禽類外，部分亞型也能夠引起人感染或發(fā)病。野生水禽是禽流感病毒的自然宿主，一般對其不致病，當(dāng)它們傳染給其它物種時(shí)有時(shí)會造成大的發(fā)病率和死亡率。2013 年我國*報(bào)道了人感染 H7N9 型 AIV，至 2015 年有 571 例感染，212 人死亡。H7N9 AIV 對禽類表現(xiàn)低致病性，它引起家禽很輕微的或不引起臨床癥狀，但對人卻表現(xiàn)很高的致病性[1]。

本試劑盒適用于檢測標(biāo)本中的禽流感/新城疫病毒(AIV/NDV)，適用于禽流感/新城疫病毒(AIV/NDV)感染的輔助診斷及流行病學(xué)調(diào)查。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒分別對禽流感AIV和新城疫病毒NDV設(shè)計(jì)特異性的引物和探針，用一步法熒光RT-PCR技術(shù)對AIV/NDV RNA進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測。

【試劑組成】

名 稱 規(guī) 格

酶液 50μL×1 管

AIV-H7N9 反應(yīng)液 1.0mL×1 管

AIV-H7N9 陽性質(zhì)控品 50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品 250μL ×1 管

注：

1）不同批號試劑不能混用。

2）試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測次數(shù)。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融少于 7 次，有效期 9 個月。

【適用儀器】

ABI 系列 、安捷倫 MX3000P/3005P 、MJ Opticon2 、Eppendorf 2/4 Color Systems、Bio-RadCFX96 等熒光定量 PCR 檢測儀。

【標(biāo)本采集】

病死或撲殺禽，取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織；待檢活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物，置于 1mL 50%甘油生理鹽水中。

【保存和運(yùn)輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中， 8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；棉拭子直接取 100 μL 提取。

1.2RNA 提取

推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的 RNA 提取試劑盒（離心柱提取法），請按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑 AIV-H7N9 反應(yīng)液 酶液

用量 20μL 1μL

將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，21uL/管。

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 RNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2

設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；熒光通道選擇： 檢測通道

（Reporter Dye）FAM、CY5， 淬滅通道（Quencher Dye）選擇 NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟 循環(huán)數(shù) 溫度 時(shí)間 收集熒光信號

1 1cycle 42℃ 20min 否

2 1 cycle 95℃ 10min 否

3 40 cycle 94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí)，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

FAM 通道為禽流感病毒 H7N9 亞型 H7 基因檢測結(jié)果，CY5 通道為禽流感病毒H7N9 亞型 N9 基因檢測結(jié)果

陽性：檢測通道 Ct 值≤35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線。

可疑：檢測通道 Ct 值>35.0，且出現(xiàn)明顯擴(kuò)增曲線的樣本建議重復(fù)試驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn) Ct 值≤35.0 和明顯擴(kuò)增曲線者為陽性，否則為陰性。

陰性：樣本檢測結(jié)果無 Ct 值且無明顯的擴(kuò)增曲線。

6.檢測方法的局限性

樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

陽性對照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

病原體在流行過程中基因突變、重組，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

不同的提取方法存在提取效率差異，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定   量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果；

本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

7.質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：無明顯擴(kuò)增曲線且無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足，否則實(shí)驗(yàn)視為無效。

【注意事項(xiàng)】

所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行；

試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，*混勻并短暫離心；

反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)工作服；

樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；

實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通   則》進(jìn)行處理。

【參考文獻(xiàn)】

[1]Morens D M, Taubenberger J K, Fauci A S. H7N9 avian influenza A virus and the perpetual challenge of potential human pandemicity [J]. MBio，2013, 4(4): e00445-13.

[2]羅思思, 謝芝勛, 劉加波, 等. H7N9 亞型 AIV 雙重實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 檢測方法的建立[J]. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2013, 34(12):1-5.

[3]徐曉龍, 包紅梅, 馬 勇, 等. H7 和 N9 亞型及 A 型流感病毒多重?zé)晒?RT-PCR 檢測方法的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2014, 12, 36: 939-942.

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