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            人抗中性粒細(xì)胞核周抗體(pANCA)ELISA試劑盒實(shí)驗使用說明書

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              人抗中性粒細(xì)胞核周抗體(pANCA)ELISA試劑盒實(shí)驗使用說明書 本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命,追求企業(yè)競爭力的不斷提升。公司在經(jīng)營中始終秉承:遵紀(jì)守法,嚴(yán)于律己,寬仁以待,敢于承擔(dān)的企業(yè)精神作為標(biāo)準(zhǔn),以過硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來維護(hù)和拓展市場,較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏,是我們的發(fā)展目標(biāo),本生,您信任的合作伙伴!本生試劑盒

              人抗中性粒細(xì)胞核周抗體(pANCA)ELISA試劑盒的實(shí)驗使用說明書如下:

              一、實(shí)驗?zāi)康?/p>

              本試劑盒用于檢測人血清、血漿及相關(guān)液體樣本中人抗中性粒細(xì)胞核周抗體(pANCA)水平。

              二、實(shí)驗原理

              本試劑盒采用雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定標(biāo)本中人抗中性粒細(xì)胞核周抗體(pANCA)。用純化的抗原包被微孔板,制成固相抗原,可與樣品中抗中性粒細(xì)胞核周抗體(pANCA)相結(jié)合,經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗體和其他成分后再與HRP標(biāo)記的抗原結(jié)合,形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物。經(jīng)過洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中pANCA的含量呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),與CUTOFF值相比較,從而判定標(biāo)本中人抗中性粒細(xì)胞核周抗體(pANCA)的存在與否。

              三、樣本處理

              ?血清?:室溫血液自然凝固10~20分鐘,離心20分鐘左右(2000~3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過程中如出現(xiàn)沉淀,應(yīng)再次離心。

              ?血漿?:應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合10~20分鐘后,離心20分鐘左右(2000~3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)該再次離心。

              ?尿液?:用無菌管收集,離心20分鐘左右(2000~3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。

              ?細(xì)胞培養(yǎng)上清?:檢測分泌性的成份時,用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000~3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時,用PBS(PH7.2~7.4)稀釋細(xì)胞懸液,細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融,以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右(2000~3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。

              ?組織標(biāo)本?:切割標(biāo)本后,稱取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩?biāo)本融化后仍然保持2~8℃的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000~3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測,其余冷凍備用。

              四、實(shí)驗步驟

              ?編號?:將樣品對應(yīng)微孔按序編號,每板應(yīng)設(shè)陰性對照2孔、陽性對照2孔、空白對照1孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步操作相同)。

              ?加樣?:分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照50μl。然后在待測樣品孔先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl。

              ?溫育?:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

              ?配液?:將30倍濃縮洗滌液加蒸餾水至600ml后備用。

              ?洗滌?:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復(fù)5次,拍干。

              ?加酶?:每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,空白孔除外。

              ?溫育?:操作同3。

              ?洗滌?:操作同5。

              ?顯色?:每孔先加入顯色劑A 50μl,再加入顯色劑B 50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15分鐘。

              ?終止?:每孔加終止液50μl,終止反應(yīng)(此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。

              ?測定?:以空白空調(diào)零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

              五、結(jié)果判定

              ?試驗有效性?:陽性對照孔平均值≥1.00;陰性對照平均值≤0.10。

              ?臨界值(CUT OFF)計算?:臨界值=陰性對照孔平均值+0.15。

              ?陰性判定?:樣品OD值<臨界值(CUT OFF)者為抗中性粒細(xì)胞核周抗體(pANCA)陰性。

              ?陽性判定?:樣品OD值≥臨界值(CUT OFF)者為抗中性粒細(xì)胞核周抗體(pANCA)陽性。

              六、注意事項

              操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行,本試劑不同批號組分不得混用。

              試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15~30分鐘后方可使用,酶標(biāo)包被板開封后如未用完,板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

              濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,洗滌時不影響結(jié)果。封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。

              底物請避光保存。

              試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn),使用雙波長檢測時,參考波長為630nm。

              所有樣品、洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。終止液為2M的硫酸,使用時必須注意安全。

              七、保存條件與有效期

              ?保存條件?:2~8℃低溫冷藏。

              ?有效期?:6個月。

              請嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行實(shí)驗操作,以確保實(shí)驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。


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