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　　本生帶您了解：ELISA實(shí)驗(yàn)中常見問題和注意事項(xiàng)

　　用于ELISA測定的臨床標(biāo)本最為常用的是血清(漿)。本實(shí)驗(yàn)室用ELISA測定乙肝兩對半，甲肝，戊肝，抗HIV的標(biāo)本時，在處理和保存方面要考慮以下幾個方面：

　　1)要注意避免出現(xiàn)嚴(yán)重溶血及血清中混有紅細(xì)胞。當(dāng)標(biāo)本出現(xiàn)嚴(yán)重溶血及血清中混有紅細(xì)胞時，反應(yīng)孔不易洗凈，殘留在反應(yīng)孔內(nèi)的血紅蛋白具有過氧化物酶的活性，顯色時可能造成假陽性。

　　2)標(biāo)本凝固不全強(qiáng)行離心，造成血清中含有少量的纖維蛋白原，在實(shí)驗(yàn)過程中形成纖維蛋白吸附在反應(yīng)孔孔壁上不易洗掉，易造成假性結(jié)果。

　　3)血清標(biāo)本可在2～8℃下保存1周。如血清樣本需長時間保存，則需放入-20℃冰柜內(nèi)冰凍保存。冰凍保存的血清標(biāo)本須注意避免反復(fù)凍融，標(biāo)本可能引起假陰性結(jié)果。此外凍融標(biāo)本的混勻不要進(jìn)行劇烈振蕩，應(yīng)反復(fù)顛倒混勻。

　　ELISA測定中試劑準(zhǔn)備

　　在實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒先從冰箱中拿出來，在室溫下放置20分鐘以上后，再進(jìn)行測定，證試劑盒溫度要和室溫一致。如果把試劑盒從冰箱拿出來直接做實(shí)驗(yàn)會造成一些弱陽性標(biāo)本的檢測出現(xiàn)假陰性。因?yàn)樵诤竺娴姆跤磻?yīng)步驟中，造成孵育時間不夠。其次，ELISA實(shí)驗(yàn)中洗板用的洗液需每日更換配制，稀釋時所用的蒸餾水或去離子水應(yīng)保證質(zhì)量。

　　加血清樣本及反應(yīng)試劑

　　血清樣本使用微量加樣槍加樣。使用微量加樣槍加樣必須注意避免以下幾點(diǎn)：

　　1)加樣太快，無法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。需勻速加樣，吸樣時，加樣槍需按到第一檔，加樣時，加樣槍需直接按到底。

　　2)加樣應(yīng)直接加入反應(yīng)孔底部，加在反應(yīng)孔孔壁上易濺出會對鄰近孔產(chǎn)生污染。盡量避免出現(xiàn)氣泡。

　　3)反應(yīng)試劑的加入時先要注意試劑的有效期，再注意滴加的角度和滴加的速度。滴加太快易出現(xiàn)重復(fù)滴加或加在兩孔之間。

　　溫育的時間與溫度

　　溫育是ELISA測定中最容易出現(xiàn)問題的步驟。溫育溫度應(yīng)在37℃，水浴。溫育時間應(yīng)按照試劑說明書上的時間嚴(yán)格執(zhí)行。溫育實(shí)際測定操作中要注意以下幾點(diǎn)：

　　1)要保證在設(shè)定的溫度下有足夠的反應(yīng)時間。溫育時間不夠，弱陽性樣本測不出來。

　　2)因?yàn)椴捎盟?，所以在溫育時一定要封板，防止水蒸氣形成水滴掉入反應(yīng)孔內(nèi)造成污染，并有可能整板花板。

　　ELISA測定的洗板

　　全自動洗板機(jī)的使用應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：

　　1)洗板前，應(yīng)檢查洗液瓶、蒸餾水瓶是否充足，廢液瓶是否滿瓶

　　2)在自檢過程中注意觀察洗液灌注是否通暢，排液是否通暢。

　　3)在洗板過程中，應(yīng)注意觀察反應(yīng)孔每孔是否灌滿且無外溢，每孔吸水是否吸盡，并且要保證洗液在孔中放置的時間。

　　ELISA測定以TMB為底物的顯色

　　加入底物開始顯色反應(yīng)前，最好是先檢查一下底物溶液的有效期。滴入A、B顯色劑后，需溫育15min，最后加入終止液終止反應(yīng)，振蕩混勻后即可進(jìn)行下面的比色測定判斷結(jié)果。在此過程中應(yīng)注意不要把顯色劑和終止液滴入順序弄反，否則重做實(shí)驗(yàn)。

　　ELISA的比色測定

　　ELISA的比色測定由酶標(biāo)儀進(jìn)行測定，故需強(qiáng)調(diào)比色測定時，一定要注意酶標(biāo)儀的波長是否是雙波長(450nm和630nm)。

　　ELISA測定結(jié)果判定

　　結(jié)果判定一般是根據(jù)比色結(jié)果和肉眼觀察綜合判定。如在判定過程發(fā)現(xiàn)有些反應(yīng)孔出現(xiàn)倒陰不陽的現(xiàn)象或出現(xiàn)不常見的模式(如乙肝兩對半中出現(xiàn)12陽性等)，需本著嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度，重新復(fù)查。

　　對ELISA測定中出現(xiàn)問題的可能原因(非試劑盒本身的原因)，總結(jié)如下：

　　1)弱陽性質(zhì)控樣本檢測不出溫育的時間或溫度不夠;顯色反應(yīng)時間太短;所用配制緩沖液的蒸餾水有問題。

　　2)測定的重復(fù)性差，這是由于測定操作引起的問題，包括

　?、偌訕颖炯霸噭┝坎粶?zhǔn);孔間不一致

　　②加樣過快，孔間發(fā)生污染

　　③加錯樣本

　?、芗訕颖炯霸噭r，加在孔壁

　　⑤不同批號試劑盒中組分混用

　?、逌赜龝r間、洗板、顯色時間不一致

　?、呖變?nèi)污染雜物，

　　血清標(biāo)本未凝固即加入，反應(yīng)孔內(nèi)出現(xiàn)纖維蛋白凝固或殘留血細(xì)胞，易出現(xiàn)假陽性等。

　　3)全部孔都不顯色

　　①漏加酶結(jié)合物;

　?、谙窗逡号渲浦谐霈F(xiàn)問題

　　③漏加顯色劑A或B

　?、芙K止劑當(dāng)顯色劑使用

　　4)全部板孔均有顯色

　?、侔宀桓蓛?/p>

　　②顯色液變質(zhì)

　?、巯窗逡菏苊傅任廴?/p>