重組酶介導(dǎo)鏈置換核酸擴(kuò)增（Recombinase-aid Amplification，RAA），是一種恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù)。RAA是利用從細(xì)菌或真菌中獲得的重組酶在常溫下可與引物DNA緊密結(jié)合，形成重組酶/引物復(fù)合體，侵入RNA-cDNA雙鏈核酸模板，在侵入位點重組酶將雙鏈打開，同時單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合到被重組酶打開的單鏈上，維持雙鏈模板處于開鏈狀態(tài)。重組酶/引物復(fù)合體開始對雙鏈進(jìn)行掃描，當(dāng)引物在模板上搜索到與之完(空)全匹配的互補(bǔ)序列時，重組酶/引物復(fù)合體解體，DNA聚合酶結(jié)合到引物的3’端，開始合成新鏈。合成的新鏈又可以作為模板，最終擴(kuò)增產(chǎn)物以指數(shù)級增長，完成靶標(biāo)基因的擴(kuò)增，可用電泳法進(jìn)行判讀。RAA凍干顆粒具有快速、靈敏度高以及特異性強(qiáng)等優(yōu)點，反應(yīng)組分已混合并冷凍干燥成核酸擴(kuò)增試劑，操作簡便，易于保存。

檢測原理：

RAA凍干顆粒是基于重組酶介導(dǎo)鏈置換核酸擴(kuò)增（Recombinase-aid Amplification，RAA）技術(shù)開發(fā)的恒溫核酸擴(kuò)增檢測試劑，在39～42℃恒溫條件下特異識別并擴(kuò)增目標(biāo)樣本的核酸片段，可配合電泳法進(jìn)行檢測判斷。

產(chǎn)品用途：

RAA凍干顆?？蓱?yīng)用于核酸DNA 的快速擴(kuò)增。

儲存及有效期：

本產(chǎn)品存儲于2~28℃、干燥、避光條件下，有效期為12 個月。

引物設(shè)計：

RAA核酸擴(kuò)增技術(shù)對引物設(shè)計的要求與常規(guī)PCR引物設(shè)計有一定的區(qū)別。由兩條寡核苷酸組成一對引物，分別特異性識別一個核酸目標(biāo)物的上下游核苷酸序列；引物長度在28-35 nt之間，序列中無回文序列、連續(xù)單堿基重復(fù)序列和內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)區(qū)；引物Tm值不作為設(shè)計時主要考慮因素。建議在開展RAA（基礎(chǔ)型）擴(kuò)增反應(yīng)之前，先進(jìn)行引物的篩選試驗，以便得到較高的檢測靈敏度。

探針設(shè)計建議方法：探針長度在46-52 nt之間，序列避免回文序列、內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)和連續(xù)的重復(fù)堿基；探針的5’端用一種抗原標(biāo)記物標(biāo)記，通常為FAM基團(tuán)或羧基熒光素；內(nèi)部含有堿基核苷酸類似物替換核苷酸（例如四氫呋喃殘基THF-有時稱為'dSpacer'）；3’末端有聚合酶延伸阻斷基團(tuán)（例如C3-spacer，磷酸基或雙脫氧核苷酸）。如下圖所示：

注意：在開始實驗前檢查探針5’端標(biāo)記的基團(tuán)與下游引物5’端標(biāo)記的基團(tuán)是否與所用的試紙條相匹配；建議在開展 RAA試紙條型擴(kuò)增反應(yīng)之前，先進(jìn)行引物的篩選試驗，以便得到較高的檢測靈敏度。

產(chǎn)品說明：

1. 本產(chǎn)品是“Ready to Use"即用型 RAA凍干顆粒；含有除引物所有的反應(yīng)要素，如重組酶、DNA 聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP 、ATP和PEG 35000等。

2. 試劑盒最(空)低檢測下限為 10-100copies/測試（依據(jù)引物篩選優(yōu)化程度和檢測手段）。

3. RAA試劑，僅擴(kuò)增DNA。

4. 基礎(chǔ)型試劑，適用于電泳法分析條帶。

適用儀器：

恒溫金屬浴、恒溫水浴鍋。

檢測步驟：

1. 核酸樣本提?。赫垍⒖紓鹘y(tǒng)DNA 提取方法或其他同效商品化試劑盒提取DNA樣本。

2. 操作步驟

2.1 根據(jù)反應(yīng)數(shù)量，按照反應(yīng)體系配制含有水、上游引物(10 μM)、下游引物(10 μM)的 Mix，混合均勻后加入裝有核酸擴(kuò)增試劑的檢測單元管中；

2.2 向檢測單元管中加入經(jīng)步驟1處理得到的待測DNA樣本；

2.3 再向檢測單元管蓋上加入1.5~2.5 μL 的Mg2+，蓋上管蓋，上下顛倒 輕甩充分混勻5-6次，低速離心10 sec； （注：本步驟“是否充分混勻"將決定實驗結(jié)果的重復(fù)性）

2.4 將檢測單元管放入37~40℃ 恒溫金屬?。ɑ蚝銣厮″仯┲?，孵育30min。

結(jié)果分析與判定：

可以根據(jù)瓊脂糖電泳、試紙條或熒光法判定實驗結(jié)果。

注意事項：

1. 試劑條檢測，推薦使用免開蓋的裝置進(jìn)行試紙條檢測，避免氣溶膠污染。

2. 開始檢測前請仔細(xì)閱讀本說明書全文，并嚴(yán)格按照要求進(jìn)行操作。

3.不同類型樣品所提取的核酸含量和純度有差異，可能導(dǎo)致擴(kuò)增效率不同。

4.當(dāng)實驗室環(huán)境、試劑、儀器或配件存在陽性物質(zhì)（例如質(zhì)粒、擴(kuò)增產(chǎn)物等）污染，或樣本間存在交叉污染的情況時，會影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確性，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

5. 務(wù)必保證試劑保存、配制或運輸?shù)卯?dāng)，否則可能導(dǎo)致試劑檢測性能下降，出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

6. 陽性對照為質(zhì)粒，適用于評價本試劑核酸擴(kuò)增性能。

7. 請嚴(yán)格按照基因擴(kuò)增實驗室的管理規(guī)范進(jìn)行操作。 實驗結(jié)束后，檢測過程中所產(chǎn)生的廢棄物應(yīng)按照相關(guān)規(guī)范進(jìn)行處理。

相關(guān)產(chǎn)品：

HP80201 基礎(chǔ)型RAA核酸擴(kuò)增試劑（凍干顆粒）

HP80202 熒光型RAA 核酸擴(kuò)增試劑（凍干顆粒）

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HP80204 熒光型RT-RAA核酸擴(kuò)增試劑（凍干顆粒）

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