用于 MS 分析的尿蛋白的制備和 HILIC SPE 凈化
該方案描述了使用 MagReSyn® HILIC 進行自下而上蛋白質組學的尿液樣品的高效樣品制備和凈化。
材料：所有試劑和化學品應為分析級或更高級別，最好是 MS 級。
Reagent or Equipment Description and catalogue number
MagReSyn® HILIC MR-HLC002
Ammonium acetate (NH4Ac) Fluka A1542-500g
Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) Fluka 40867-50g
Dithiothreitol (DTT) VWR 0281-25G
Iodoacetamide (IAA) MERCK I1149-25G
Protein LoBind tubes Eppendorf 0030108450
Magnetic bead handling station for automated protoco KingFisher Duo or Flex
Magnetic separator for manual protocol DynaMag™-2 Magnet Catalog number: 12321D
MS grade water Pierce™ 51140
Peptide quantification method Pierce™ Colorimetric (23275) or Fluorometric (23290) Peptide Assay
Adjustable Pipettes
Sodium dodecyl sµlphate (SDS) MERCK L4509-1Kg
Urea MERCK U5378-1Kg
注意：上面建議的化學品已經過測試，可用于本協(xié)議，但也可以使用同等等級的化學品
試劑制備：
DTT Stock: 1M DTT in LCMS grade H2O (prepare fresh)
• IAA Stock: 1M IAA in LCMS grade H2O (prepare fresh, light sensitive)
• Urea sample buffer: 8M urea, 2% SDS (prepare fresh)
• Equilibration Buffer: 15% ACN, 100 mM NH4Ac pH 4.5 (diluted from 1M NH4Ac stock)
• Binding Buffer: 30% ACN, 100 mM NH4Ac pH 4.5
• Wash Buffer: 95% Acetonitrile in LCMS grade H2O
• Trypsin Digestion Buffer: 50mM NH4HCO3 LCMS grade H
注：緩沖液可在 4°C 下保存長達 2 周。
方法：
注意：
該方法是使用 Kingfisher™ 磁性處理站開發(fā)和基準測試的。如果您無法使用磁性處理站，您可以遵循下面詳述的協(xié)議（手動格式）。 • 建議新鮮制備所有緩沖液。 • 應使用標準采集程序采集尿液樣本。建議收集第一天早上干凈的尿液樣本進行臨床分析。樣品應保存在冰上，直到通過離心處理去除碎片（800 x g，10 分鐘）。如果不立即使用，等分試樣必須儲存在 -80 °C。
尿液制備
1. 在冰上解凍尿液樣本
2. 將 100 µl 尿液轉移至新的 2ml LoBind® Eppendorf 管中。
3. 添加 300 µl 尿素樣品緩沖液并渦旋混合 10 -15 秒。
4. 使用終濃度為 10 mM DTT 在室溫下還原 30 分鐘。
5. 使用最終濃度為 30 mM IAA 的烷基化蛋白質，在室溫下避光 30 分鐘。
6. 通過添加另外 10 mM DTT 來淬滅 IAA
微粒平衡：
7. 通過渦旋混合或翻轉重新懸浮 MagReSyn® HILIC，以確保均勻懸浮液。注意：當制備多個樣品時，請通過定期混合來確保保持均勻的懸浮液，例如在轉移所需體積之前倒置或上下移液微?；旌衔?。
8. 將 10 µl MagReSyn® HILIC (200 µg) 微粒轉移至 2 ml Protein Lo-Bind 管中。
9. 將管子放在磁力分離器上，等待 5-10 秒，讓微粒澄清。
10. 用移液管吸出運輸溶液并丟棄。
11. 將微粒重懸于 200 µl 平衡緩沖液（參見上文）中，同時攪拌（例如輕輕渦旋混合）15-30 秒，以洗滌微粒。
12. 將管子放在磁力分離器上，讓微粒澄清。
13. 用移液管吸出平衡溶液并丟棄。
14. 重復步驟 12 – 14。注意：只有在準備好添加樣品后，才從微粒中取出第二個平衡溶液（參見下面的步驟 15）。這將確保微粒不會風干，并且在添加樣品時可以輕松地重新懸浮。
樣品結合和清洗：
15. 將（來自步驟 6）還原和烷基化的樣品與 (416 µl) 結合緩沖液（30% ACN，100 mM NH4Ac pH 4.5）以 1:1 (v/v) 比例混合。
16. 轉移尿素樣品緩沖液 - 將緩沖液混合物與步驟 14 中的平衡微粒結合。注意：如果自動化工作流程，請參閱儀器的體積參數(shù)，以確保凈化的兼容性。
17. 在室溫下孵育 30 分鐘并持續(xù)混合（例如緩慢渦旋）以確保樣品和微粒充分相互作用。
18. 將管子放在磁力分離器上，讓微粒澄清。用移液器抽吸除去并丟棄未結合的部分。
19. 用 200 µl 洗滌緩沖液洗滌微粒，并輕輕攪拌混合 60 秒。可選：可以將微?；旌衔镛D移到新的 2ml Protein Lo-Bind 管中，以確保留在管側壁上的污染物在后續(xù)消化步驟中不會重新引入樣品中。
20. 將管放在磁力分離器上，并允許 5 -10 秒清除微粒。除去上清液并丟棄。 21. 重復步驟 19 和 20 中描述的清洗步驟。
珠上蛋白質消化：
22. 通過添加 200 µl 50 mM 碳酸氫銨 pH 8.0（含有 1 µg 測序級胰蛋白酶（酶：蛋白質比例 1:30））進行珠上消化，并在 47 °C 下孵育 2 小時。確保充分混合以使顆粒在消化過程中保持在溶液中?？蛇x：還可以將 0.25 µg 測序級 LysC 添加到消化緩沖液中以改善消化。
23. 將管子放在磁力分離器上，等待 5-10 秒，讓微粒澄清。
24. 取出肽溶液并放入 0.5 ml Eppendorf LoBind 管中?？蛇x：為了提高肽回收率，可以將微粒與 50 至 100 µl 1% TFA 一起孵育 5 分鐘，同時混合，然后將上清液與步驟 29 中的消化溶液合并。
25. 對樣品進行真空或冷凍干燥并重懸于 20-40 µl LCMS 溶劑中，例如2% ACN 和 0.2% 甲酸
26. 進行比色肽測定以確定肽回收率并調整 LC-MSMS 分析的負載。可選：可以使用比色測定來評估 HILIC 方法去除 SDS 的效率，該比色測定可以測量肽存在下的 SDS 一致性，例如 Arand、Friedberg 和 Oesch，1992 年中描述的方法。
27. 通過 LC-MSMS 分析消化物。注：如果使用不帶陷阱洗脫選項的納米 LCMS 設置，建議使用標準 C18 脫鹽工作流程進一步對消化液脫鹽
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