使用貴金屬納米顆粒綴合物進行免疫印跡

由于制備貴金屬納米顆粒（例如金和銀）的抗體綴合物相對容易，并且無需事先開發(fā)程序即可通過肉眼直接檢測，因此這些探針在許多測定中具有很大的用途。應用包括快速測試，例如橫向流動、垂直流動、蛋白質印跡和斑點印跡測定。此外，每種貴金屬納米粒子類型的光學特性 允許生成具有不同顏色的二次探針，可用于比色多重檢測，圖 1。

當用貴金屬蛋白綴合物（例如二級金綴合物）探測印跡蛋白的膜時，在納米顆粒探針結合后，目標蛋白的存在會以紅色指示，如圖 1 所示。免疫印跡和斑點印跡應用中的銀到結合的金綴合物的靈敏度可與比色檢測方法相媲美。此外，二級貴金屬納米顆粒蛋白綴合物很好地適應標準蛋白質印跡方案，并且對您當前的檢測方案幾乎不需要改變。 

與傳統(tǒng)檢測探針相比，使用貴金屬納米顆粒蛋白綴合物進行免疫印跡具有多種優(yōu)勢，例如： 

• 檢測無需開發(fā)

• 檢測不需要昂貴的成像設備

• 允許比色多重分析

以下是使用二級金綴合物檢測膜上抗原的標準斑點印跡方案。相同的方案可用于金納米海膽、銀納米顆粒和合金納米顆粒蛋白質綴合物探針。

標準免疫金斑點印跡實驗方案

1. 將 1 微升連續(xù)稀釋的蛋白質（0.1 - 100 ng）滴在添加有 50 ug/ml BSA 的 PBS 中，滴在硝酸纖維素膜或 PVDF 膜上。

2. 讓蛋白質滴干燥進入膜中。

3. 在室溫下使用 1% (w/v) 奶粉的 1X PBS 將膜封閉 30 分鐘。

4. 與一抗在室溫下孵育 2 小時。

5. 用上述制備的封閉液清洗膜 3x5 分鐘。

6. 用 0.2% 奶粉按 1:10 (OD=0.3) 稀釋的二級金結合物孵育 2 小時（或更長的時間以提高靈敏度）。注意：有關金綴合物的制備，請參閱技術說明#102。

7. 如上所述洗滌 3x5 分鐘。

8. 干燥膜并記錄數(shù)據。

9. （可選）繼續(xù)進行銀增強以提高靈敏度。

圖 1. 使用 Cytodiagnostics 膜銀增強試劑盒增強前后 Cytodiagnostics 鏈霉親和素金綴合物（左上）和我們的鏈霉親和素銀綴合物（右上）的斑點印跡分析示例。下圖展示了使用具有不同光學特性的貴金屬納米粒子綴合物的混合物同時多重檢測三種不同抗原，即抗人IgG 30nm金/銀(20/80)合金綴合物（綠色）、a-小鼠IgG 30nm金/銀 (80/20) 合金綴合物（紅色）和 a-兔 IgG 40nm 金綴合物（紫色）。

圖 2. 垂直流斑點印跡免疫分析中的多重檢測。左圖顯示 3 個抗原（紅點）和對照中的 2 個呈陽性檢測。右圖顯示使用兩種不同顏色的納米顆粒探針（紅色：金納米顆粒，藍色：金納米海膽）對兩種不同抗原的陽性檢測。 

圖 3. 使用兔抗肌動蛋白一抗對純化肌動蛋白進行蛋白質印跡檢測，然后使用 10nm 抗兔 IgG 金綴合物進行二次檢測，并使用 Cytodiagnostics 膜銀增強試劑盒進行增強。