RDA 用作生物樣品中 Fe 2+的選擇性高量子產(chǎn)率熒光標(biāo)記物。它對(duì)鐵的親和力比 RPA 略低。膜滲透性化合物的陽(yáng)離子熒光團(tuán)允許通過(guò)例如熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，并且基于線(xiàn)粒體的負(fù)膜電位，尤其靶向活細(xì)胞的線(xiàn)粒體。在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中，RDA 熒光（λ最大598 nm）會(huì)被 Fe 2+離子以化學(xué)計(jì)量（3:1）強(qiáng)烈猝滅。
A:無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中 RPA 的吸收和發(fā)射光譜（“簡(jiǎn)單緩沖溶液"(SBS) 中的 20 µM RPA：2mM 抗壞血酸、0.15% SDS 和 10mM Tris/HCl，pH 8.2）。
B:Fe 2+對(duì)“SBS"中 RPA (20-45 µM) 熒光的影響：Fe 2+是隨著硫酸亞鐵銨/脫水檸檬酸三鈉鹽 (FAS) 濃度的增加而從添加的儲(chǔ)備溶液 (1mM) 中添加的。含有 20mM 抗壞血酸，與培養(yǎng)基混合。 2 分鐘后，RPA/Fe 2+復(fù)合物形成后，測(cè)定含有已知濃度的 RPA 和 Fe 2+的培養(yǎng)基部分的熒光（以任意單位 au 表示）。零熒光等于不含染料的介質(zhì)的熒光。
RDA 選擇性地積聚在細(xì)胞（例如培養(yǎng)的肝細(xì)胞）的線(xiàn)粒體中(1,2)。當(dāng)鐵以透膜形式添加到細(xì)胞中時(shí)，線(xiàn)粒體內(nèi) RDA 熒光會(huì)被猝滅。當(dāng)添加膜滲透性過(guò)渡金屬螯合劑吡哆醛異煙酰腙和 1,10-菲咯啉后，實(shí)驗(yàn)性地減少線(xiàn)粒體可螯合鐵時(shí)，它會(huì)增加。 RDA 熒光的增加允許使用異位校準(zhǔn)對(duì)活細(xì)胞中的線(xiàn)粒體可螯合鐵進(jìn)行特異性定量(1)。
Application in a cellular system
RDA 可以按照 Lit 中的描述使用。 1. 例如，在蓋玻片上培養(yǎng)的活細(xì)胞與 RDA（0.01-10 µM，由 DMSO 中的 10 µM 或 1-5 mM 儲(chǔ)備溶液制備）在 HBSS（“Hanks 平衡"）中于 37°C 孵育 10-20 分鐘鹽溶液"）。隨后用無(wú)染料 HBSS 洗滌細(xì)胞 3 次。為了避免 RPA 與腔室結(jié)合并改善線(xiàn)粒體負(fù)載，應(yīng)在 RPA 負(fù)載后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到第二個(gè)（無(wú)指示劑）Pentz 腔室并再孵育 15 分鐘。 37°C?，F(xiàn)在應(yīng)在 37°C 下用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基（例如用于肝細(xì)胞的 HBBS 或 L-15 培養(yǎng)基）覆蓋細(xì)胞。使用例如定量激光掃描顯微鏡測(cè)定線(xiàn)粒體內(nèi)RPA熒光。 RPA 的紅色熒光在 λ exc 處被激發(fā)。= 543 nm 并通過(guò) λ exc 附近的長(zhǎng)通濾波器收集。 = 601 納米。定量和定性測(cè)量的掃描參數(shù)取決于實(shí)驗(yàn)所用的顯微鏡系統(tǒng)。測(cè)量開(kāi)始后 5-10 分鐘，可通過(guò)添加 FeCl 3 /8-羥基喹啉復(fù)合物 (5-15 µM) 或膜滲透鐵螯合劑，例如 PIH（吡哆醛異煙酰腙，2mM）來(lái)控制線(xiàn)粒體內(nèi)可螯合鐵的水平。 ) 或 1,10-菲咯啉 (2 mM)。對(duì)于對(duì)照測(cè)量，平行培養(yǎng)物加載含有一些熒光團(tuán)的鐵不敏感對(duì)照 RPAC（羅丹明 B-[（菲-9-基）氨基羰基]芐酯）。應(yīng)使用與上述相同的負(fù)載條件。
| 化學(xué)名稱(chēng)：Rhodamine B-[(1,10-phenanthroline-5-yl)-aminocarbonyl]benzyl ester (RPA)- |
分子分子式:C 48 H 44 BrN 5 O 4
分子量 [克/摩爾]:834.7981 (79.9045+754.8935)
最大吸收:λ max (log ε) = 562 nm (4.95), 510-535
最大排放量:最大波長(zhǎng)601 nm
穩(wěn)定:< 4 o C，干燥避光保存
外貌:紫色固體
純度:97%+（1 H NMR，500 MHz）
淬火化學(xué)計(jì)量:RPA/Fe 2+ : 3:1 [摩爾/摩爾]
體外毒性:無(wú)毒
(空格分隔,最多3個(gè),單個(gè)標(biāo)簽最多10個(gè)字符)
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