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            上海牧榮生物科技有限公司

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            免疫組織化學 (IHC) 故障排除

            閱讀:604      發(fā)布時間:2024-2-26
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            免疫組織化學是一個漫長的多步驟過程,可能會出現(xiàn)很多問題,并且實驗成功需要考慮很多因素。在某些時候,不可避免地會出現(xiàn)問題或不是最佳狀態(tài)。下面匯總了一些可能導致免疫組織化學結(jié)果欠佳的最常見陷阱。

            問題

            潛在原因

            建議的解決方案

            弱染色或無染色


             


             

            抗體濃度過低

            • 嘗試增加一抗?jié)舛?/span>

            • 考慮使用使用生物素化二抗的擴增系統(tǒng)

            抗體不相容性

            • 確保二抗與一抗的物種和抗體亞類兼容

            高背景會模糊信號

            • 請嘗試遵循下面本故障排除指南的“高背景或非特異性染色"部分中詳細介紹的建議。

            膜被透化試劑損壞

            • 嘗試使用較低濃度的清潔劑。

            • 嘗試使用較弱的清潔劑(例如用 Triton X-100 代替 Tween-20)

            抗體不適合 IHC

            • 有些抗體不適合 IHC 中抗原的呈現(xiàn)方式。檢查數(shù)據(jù)表,了解之前是否已在 IHC 或 ICC 中進行過測試,如果沒有,請考慮使用不同的抗體。

            • 嘗試使用不同的固定方法,該方法將以不同的方式呈現(xiàn)抗原,因此可能允許抗體結(jié)合。

            目標蛋白豐度低

            • 嘗試增加一抗?jié)舛?/span>

            • 嘗試使用放大方法,例如生物素化二抗

            固定可能會掩蓋目標表位

            • 嘗試第 5.2 節(jié)中描述的抗原修復方法之一

            抗體對組織切片的滲透性較差

            • 嘗試將抗體孵育更長時間或以更高的濃度

            • 嘗試使用更薄的組織切片

            • 嘗試使用較小的一抗(例如使用 IgG 而不是 IgM)

            通透性不足

            • 嘗試增加緩沖液中 Triton-X100 的濃度。

            • 如果使用 Tween-20,請考慮改用 Triton-X100,這是一種更強的清潔劑。

            與檢測系統(tǒng)使用不兼容的二級熒光團

            • 仔細檢查所使用的顯微鏡系統(tǒng)是否具有適合所使用熒光團的正確激發(fā)和發(fā)射濾光片。

            • 考慮使用不同的熒光團偶聯(lián)二抗。幾乎所有熒光顯微鏡至少都配備濾光片組,能夠?qū)?DAPI 和 FITC / Alexa Fluor 488 / Dylight 488 進行成像。

            安裝后熒光團降解

            • 免疫熒光切片封片后 2 天內(nèi)對切片進行成像。

            緩沖區(qū)退化

            • 使用前檢查緩沖液的 pH 值

            • 警惕細菌生長的跡象,一旦發(fā)現(xiàn)就扔掉。

            • 必要時新鮮制作。

            降解的一抗

            • 確??贵w在制造商提供的最佳使用日期內(nèi)。

            • 考慮將來分裝抗體,快速冷凍,然后儲存在 -80°C 下,以避免抗體降解的風險。

            由于光漂白而損壞熒光團共軛二抗

            • 確保使用熒光團共軛二抗時執(zhí)行的所有步驟都是在弱光或黑暗中進行

            • 成像時盡量使用盡可能低的照明來捕獲最佳圖像。這對于共焦顯微鏡尤其重要,因為高激光功率設置可以極快地漂白一些熒光團。

            • 考慮使用比 FITC 或 TRITC 等舊化合物更耐漂白的熒光團。

            不兼容的緩沖區(qū)

            • 一些抗體在基于 TBS 的緩沖液中表現(xiàn)更好,而其他抗體則更喜歡 PBS。嘗試更換緩沖液,看看這是否會增加染色。 

            過度固視

            • 嘗試減少組織與固定劑一起孵育的時間。

            • 考慮嘗試替代固定液

            多路復用時在通道之間滲透

            重疊的熒光團激發(fā)/發(fā)射光譜

            • 嘗試使用重疊有限的熒光團對(例如DAPI、Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 594)

            • 使用光譜分析工具(例如FPbase Spectraviewer確保熒光團對之間的重疊有限。

            • 嘗試使用單一抗體對照,看看一個通道中的信號是真實的還是只是由于滲漏所致。

            • 一些先進的圖像分析軟件具有可以(在一定程度上)校正滲色的功能。

            成像系統(tǒng)上的激發(fā)和發(fā)射濾光片不合適

            • 檢查熒光團和濾光片之間的兼容性,以確保每個濾光片僅捕獲熒光團。

            • 對于共焦顯微鏡,請考慮收緊允許進入檢測器的光波長窗口并使用測序,以便每個熒光團只有一個激光處于活動狀態(tài)。

            組織形態(tài)改變

            冰傷害

            • 確保在未來的實驗中按照既定方案(例如本文件中列出的方案)冷凍組織。將組織切片放入 30% 蔗糖中時,確保組織已全沉沒,否則蔗糖可能沒有足夠的時間擴散到組織中。

            • 考慮在分析中引入損傷評分系統(tǒng),以評估冰損傷是否影響實驗結(jié)果。 

            自由浮動部分的粗暴處理

            • 使用網(wǎng)等設備可以幫助減少整個協(xié)議中組織切片所需的處理量。

            • 使用優(yōu)質(zhì)細畫筆拾取和移動部分。確保沒有被低溫恒溫器/切片機刀片降解。

            • 安裝自由浮動部分時,盡量避免接觸部分,而是使用刷子飄到載玻片上。

            因儲存不當而降解

            • 如果保存不當,切片可能會被微生物生長污染。考慮使用 0.05% 疊氮hua鈉來防止儲存溶液或冷凍切片中的生長

            抗原修復過于苛刻

            • 考慮將抗原修復方法改為不太苛刻的方法

            冰凍切片從載玻片上脫落

            • 確保始終對載玻片進行處理,以確保切片更有效地粘貼。雖然有商業(yè)品種,但可以按照CSH 協(xié)議等既定協(xié)議在實驗室中對載玻片進行替換; 

            固定不佳

            • 不全固定會導致組織迅速降解。嘗試增加組織與固定劑一起孵育的時間或考慮增加固定劑的濃度。

            高背景或非特異性染色


             

            組織切片中的自熒光分子

            • 如果組織尚未灌注,請考慮在下一個實驗中進行,因為剩余的紅細胞會產(chǎn)生強烈的自發(fā)熒光。

            • 自發(fā)熒光可能是由固定劑引起的。嘗試使用不同的固定劑。

            • 確保 NaBH 4是新鮮制備的

            • 嘗試用淬滅熒光的染料(例如,Pontamine 天藍、蘇丹黑或臺盼藍)孵育切片。

            • 嘗試使用與自發(fā)熒光波長不同的熒光團(例如紅移染料,如 Alexa Fluor 680) 

            非特異性二次結(jié)合

            • 運行無初級對照以評估次級對照是否與組織切片結(jié)合。

            • 如果一抗與組織來自同一物種,這可能會導致重大問題。請參閱本協(xié)議或考慮使用不同種類的一抗。 

            一抗?jié)舛冗^高

            • 嘗試降低一抗?jié)舛?/span>

            二抗?jié)舛冗^高

            • 嘗試降低二抗的濃度。我們發(fā)現(xiàn) 1:300 至 1:500 的稀釋度是一個不錯的起點。

            抗體純化不充分

            • 未純化的多克隆抗體可能含有與一系列非靶蛋白發(fā)生交叉反應的抗體。檢查數(shù)據(jù)表;理想情況下,應使用免疫原作為誘餌,通過親和層析純化多克隆抗體。 

            • 雖然單克隆抗體的問題較少見,但仍應至少使用 Protein A 或 G 親和層析進行純化。

            • 如果有其他替代品,請考慮改用更好的純化抗體,或者如果沒有其他替代品,請考慮內(nèi)部純化抗體。  

            阻擋不足

            • 確保封閉血清與培養(yǎng)二抗的物種相同。

            • 嘗試使用不同的阻塞解決方案。

            • 嘗試增加封閉步驟的長度或增加血清濃度

            洗滌不足

            • 嘗試增加洗滌的時間和/或次數(shù)。

            • 確保洗滌期間有足夠的攪拌,以幫助未結(jié)合的抗體擴散出組織

            一抗與組織切片來自同一物種。

            • 運行無初級對照以評估次級對照是否與組織切片結(jié)合。

            • 如果一抗與組織來自同一物種,這可能會導致重大問題。請參閱本協(xié)議第 4.3 節(jié)或考慮使用不同種類的一抗。

            內(nèi)源酶活性(用于顯色檢測)

            • 嘗試用特定抑制劑阻斷內(nèi)源酶活性。

            對于 HRP 結(jié)合二抗,使用 0.3% H 2 O 2 10-15 分鐘。如果在此濃度下封閉不成功,請考慮增加至 3%。 

            對于 AP 結(jié)合二抗,請使用 2mM 左旋咪唑。 

             

            部分已經(jīng)干了

            • 確保切片始終保持濕潤,并在加濕室中使用載玻片安裝方案進行長時間孵育。

            底物過多(用于顯色檢測)

            • 嘗試降低底物濃度或孵育時間。

            信號放大率過高(如果使用生物素化二抗)

            • 嘗試降低擴增試劑或二抗的濃度。

            • 考慮信號放大是否必要或者標準方法是否有效。

            組織切片厚度

            • 組織切片越厚,寬視野顯微鏡中的散射光越多。嘗試使用更薄的開關(guān)部分或共焦顯微鏡。


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