快速可靠的分析是工藝開發(fā)過(guò)程中的關(guān)鍵。外泌體工藝開發(fā)的過(guò)程監(jiān)控也是一大挑戰(zhàn)。各類囊泡的尺寸都超出了體積排阻色譜的分辨范圍。外泌體吸收很少的紫外線，這使得它們難以從有更豐富和更強(qiáng)的吸收紫外線能力的宿主蛋白質(zhì)和DNA（尤其是以殘留染色質(zhì)的形式）中進(jìn)行色譜檢測(cè)和區(qū)分，特別是以殘余染色質(zhì)的形式。

外泌體和其他囊泡類型是復(fù)合脂質(zhì)膜組合體，并含有自身的核酸和多種蛋白質(zhì)。它們?cè)诤軐挼姆肿恿糠秶鷥?nèi)產(chǎn)生會(huì)多個(gè)不同強(qiáng)度的條帶，這使得不同囊泡類型之間的電泳條帶很難區(qū)分，尤其是在污染宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的背景下。其中一些阻礙可以克服，但這需要時(shí)間。

對(duì)于外泌體特異性抗原，可以通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）增強(qiáng)電泳，但這很費(fèi)力，需要將測(cè)定時(shí)間增加到至少兩天。ELISA 可以自動(dòng)化以增加通量，但仍然需要將近兩天的時(shí)間。斑點(diǎn)印跡法（Dot-blotting）缺乏Western blotting和 ELISA 的靈敏度和特異性，并且仍然需要一天中的黃金時(shí)間。此外，建立高質(zhì)量的抗體庫(kù)這本身就是一個(gè)項(xiàng)目。這些額外的要求大大增加了分析負(fù)擔(dān)，也會(huì)往往阻礙對(duì)純化選項(xiàng)的深入探究。

BIA本系列的三篇文章聚焦于外泌體分析純化的挑戰(zhàn)。本文是該系列的第二篇，介紹可實(shí)現(xiàn)外泌體在線色譜檢測(cè)的新分析方法。一種方法可以將細(xì)胞外囊泡與非囊泡污染物區(qū)分來(lái)，一種方法有可能將外泌體與其他囊泡區(qū)分開來(lái)。示例說(shuō)明了如何能夠開發(fā)更有效和更有據(jù)可查的純化方法。
 

外泌體過(guò)程監(jiān)測(cè)的新分析方法：

在線 SEC-MALS/UV

然而需要強(qiáng)調(diào)的是，該峰不僅僅由外泌體組成：它包含所有細(xì)胞外囊泡和高分子量聚集體，還可能進(jìn)一步包括病毒、脂質(zhì)-脂蛋白結(jié)合和細(xì)胞碎片。然而，MALS 使得一些只能通過(guò)UV吸光度法微弱地檢測(cè)到的產(chǎn)物群體變得可見。MALS 還可用于獲取有關(guān)峰內(nèi)產(chǎn)物大小分布的信息。為了提供有關(guān)任何單一產(chǎn)物大小的有效信息，它必須以純化合物的形式被洗脫。
 

 混合物產(chǎn)生的結(jié)果表示組分的平均大小，根據(jù)每個(gè)組分在整個(gè)樣本中所占的比例進(jìn)行重量平均，但 MALS 仍然可以提供有用的信息。圖2將部分純化外泌體制備物的SEC實(shí)驗(yàn)中的旋轉(zhuǎn)半徑圖與散射強(qiáng)度進(jìn)行了對(duì)比。請(qǐng)注意，表觀尺寸通過(guò)空隙峰的前側(cè)迅速下降，表明較大的產(chǎn)物在該區(qū)域富集。峰的其余部分似乎由與外泌體大小范圍相同的產(chǎn)物組成。應(yīng)該理解的是該圖中較大顆粒的尺寸大小因?yàn)樗鼈兣c較小顆?；旌隙坏凸懒?，而較小顆粒的尺寸由于它們與較大顆粒的混合而被高估了，但是對(duì)于說(shuō)明它們相對(duì)的分布情況仍然非常有用。純物質(zhì)的尺寸分布往往產(chǎn)生水平的半徑圖。

 SEC-MALS/FLD 聯(lián)合免疫熒光

蛋白免疫印跡分析但其速度慢、勞動(dòng)密集和非定量的局限性嚴(yán)重加重了純化工藝開發(fā)和生產(chǎn)制造流程的負(fù)擔(dān)。

將 MALS 與梯度色譜方法相結(jié)合，可以在色譜圖上直接顯示囊泡，并進(jìn)行定量檢測(cè)，無(wú)需額外的時(shí)間和勞動(dòng)力。進(jìn)一步整合熒光增加了免疫學(xué)確認(rèn)以及 MALS 的大小區(qū)分。即使使用 MALS/IF-SEC 對(duì)分?jǐn)?shù)進(jìn)行二次評(píng)估，也可以比從蛋白印跡分析更快的獲得結(jié)果，并且它們是定量的。

這些新的分析工具，使得探索外泌體純化技術(shù)變得可行，這些技術(shù)比用于實(shí)現(xiàn)外泌體富集和宿主細(xì)胞污染物減少的基本方法有更高的能力。

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我們將繼續(xù)介紹：

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本文來(lái)源：BIA Separations

一直以來(lái)，BIA Separations是具有質(zhì)粒DNA、AAV、mRNA高效率純化。不僅提供整體柱及平臺(tái)方法，還提供定制的純化服務(wù)，以滿足質(zhì)粒DNA、AAV、mRNA規(guī)?；a(chǎn)的純化需求。

陰離子交換色譜的效用也表明陽(yáng)離子交換色譜應(yīng)該也是有用的。蛋白印跡分析表明一些外泌體結(jié)合而另一些則不結(jié)合（未顯示）。陰離子交換和陽(yáng)離子交換結(jié)果均可通過(guò)系統(tǒng)修改柱平衡和洗脫條件進(jìn)行調(diào)整。疏水相互作用層析和其他梯度方法擴(kuò)展了選擇范圍。將這些方法中的任何一種與 MALS 相結(jié)合，可以大大簡(jiǎn)化為實(shí)現(xiàn)特定分離而進(jìn)行的發(fā)掘和優(yōu)化任務(wù)。

遺憾的是，IF 不能與梯度色譜法聯(lián)合使用?？贵w和與其偶聯(lián)的熒光團(tuán)具有強(qiáng)電荷和疏水性特征。結(jié)合到囊泡表面后免疫偶聯(lián)物可以影響囊泡保留。在大多數(shù)情況下，這會(huì)導(dǎo)致標(biāo)記的囊泡在與抗體偶聯(lián)物相同的位置洗脫。只有尺寸排阻色譜（SEC）支持IF檢測(cè)，但這種情況下也不理想。

從邏輯上講，結(jié)合到囊泡外部會(huì)產(chǎn)生更大尺寸的復(fù)合物。因?yàn)槟遗葜饕诖笮^(qū)分為零的空隙體積中洗脫，所以效果是可以容忍的，至少對(duì)于使用小合成熒光團(tuán)的免疫偶聯(lián)物而言是這樣。使用大蛋白熒光團(tuán)如藻紅蛋白 (240 kDa) 的偶聯(lián)物可能會(huì)掩蓋對(duì)于小熒光團(tuán)偶聯(lián)物來(lái)說(shuō)會(huì)很明顯區(qū)分的囊泡大小的差異。