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創(chuàng)凌生物淺析免疫共沉淀Co-IP
閱讀：1266 發(fā)布時(shí)間：2020-9-16免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）
一、實(shí)驗(yàn)原理
以（抗體和抗原）之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究（蛋白質(zhì)相互作用）的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整（細(xì)胞內(nèi)生理性）相互作用的有效方法。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。
CO-IP應(yīng)用與IP區(qū)別
1、測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合
2、確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔
CO-IP與IP只取決于檢測焦點(diǎn)是初級靶分子（抗原）還是次級靶分子（相互作用蛋白）
二、實(shí)驗(yàn)過程
1、提取蛋白。
2、在細(xì)胞裂解液中加入抗X的抗體。
3、孵育后再加入Protein A或G(于Agarose 或magnetic beads等介質(zhì)上)。
若細(xì)胞中有與興趣蛋白結(jié)合的目的蛋白，就可以形成復(fù)合物：“Y—X—抗X抗體—Protein A或G"
4、經(jīng)變性、聚丙烯酰胺凝膠電泳，復(fù)合物又被分開。（xy抗原、x抗體）。
5、western blot分析，質(zhì)譜分析。
（Protein A是一種金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì)，能特異性地與人和哺乳動物抗體（主要是IgG）的Fc區(qū)結(jié)合。）
ProteinA/G的作用及原理
“捕獲”抗體，形成復(fù)合物，
抗體-目的蛋白-ProteinA/G beads 非共價(jià)健結(jié)合
ProteinA/G- beads 共價(jià)結(jié)合
三、CO-IP特征
優(yōu)點(diǎn)：
1、相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)。
2、蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響。
3、可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。
局限性：
1、可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用
2、兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，有第三者在中間起橋梁作用；
3、必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測目的蛋白是什么，以選擇后檢測的抗體，若預(yù)測不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果
四、實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵
1、實(shí)驗(yàn)需要注意點(diǎn)就是抗體的性質(zhì)。特別是多抗的特異性是問題。
2、為防止蛋白的分解、修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白酶抑制劑，低溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
3、考慮抗體/緩沖液的比例?？贵w過少就不能檢出抗原，過多則就不能沉降在beads上，殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過多則抗原被稀釋。
4、確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞中，而不是由于細(xì)胞的溶解才發(fā)生的，這需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的定位來確定。
五、注意的問題：
1、裂解液
(1)、細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（NP40或Triton X-100)。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過經(jīng)驗(yàn)確定。
(2)、不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS)，細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的cocktail
2、免疫沉淀中抗體的選擇
3、抗體
使用對照抗體：（陰性和陽性）
陰性：單克隆抗體：同一種屬的IgG
兔多克隆抗體：正常兔IgG
陽性：細(xì)胞內(nèi)某種蛋白的抗體（做膜蛋白A，用膜蛋白B）
六、未檢測到目得蛋白或蛋白很少
可能原因
1、樣品被蛋白酶降解：
添加蛋白酶抑制劑；所有操作保持4℃以下冰上操作并防止凍融
2、抗體濃度太低：
調(diào)整抗體濃度，必要時(shí)設(shè)立濃度梯度，摸索較佳濃度
3、抗抗體親合力太低：
選用適合于IP和/或IB的相應(yīng)抗體
4、IP抗體未與珠子結(jié)合：
選用適合于IP的相應(yīng)珠子，正確保存防止變質(zhì)或干燥
5、Tag未暴露在融合蛋白構(gòu)象的表面：
改變tag融合表達(dá)部位
6、裂解液嚴(yán)謹(jǐn)度太高：
改用低嚴(yán)謹(jǐn)度裂解液
七、目得蛋白高背景
可能原因
1、非特異蛋白結(jié)合：
（1）在無血清培養(yǎng)液中裂解細(xì)胞；
（2）在免疫沉淀前用protein (G/A)珠子預(yù)洗，
（3）免疫沉淀后增加漂洗次數(shù)和嚴(yán)謹(jǐn)度（高鹽或去垢劑）
2、裂解液嚴(yán)謹(jǐn)度太低：
改用高嚴(yán)謹(jǐn)度裂解液。
3、實(shí)驗(yàn)儀器或液體被污染：
使用潔凈的儀器或液體。
4、轉(zhuǎn)移膜上的非特異吸附：
戴手套，用鑷子夾取，不要接觸膜轉(zhuǎn)移面。