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細(xì)胞劃痕實驗原理及步驟及注意事項
閱讀：10046 發(fā)布時間：2020-9-18細(xì)胞劃痕實驗原理
細(xì)胞劃痕實驗(Wound Healing)是一種操作簡單，經(jīng)濟實惠的研究細(xì)胞遷移/腫瘤侵襲的體外試驗方法。這種方法的原理是，當(dāng)細(xì)胞長到融合成單層狀態(tài)時，在融合的單層細(xì)胞上人為制造一個空白區(qū)域，稱為“劃痕”，劃痕邊緣的細(xì)胞會逐漸進(jìn)入空白區(qū)域使“劃痕”愈合，在一定程度上模擬了體內(nèi)細(xì)胞遷移的過程，是研究細(xì)胞遷移的體外實驗中簡單的方法。細(xì)胞劃痕實驗是一種簡單易行的檢測細(xì)胞運動的方法，實驗成本低，可以用來檢測貼壁生長腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。
實驗材料：細(xì)胞樣品
儀器、耗材：6孔板 marker筆 直尺 *頭 20微升槍頭(滅菌)
試劑、試劑盒：無血清培養(yǎng)基、PBS
實驗步驟：
一.準(zhǔn)備：
所有能滅菌的器械都要滅菌，直尺和marker筆在操作前紫外照射30min（超凈臺內(nèi)）
二.流程：
(1)準(zhǔn)備工作：所有能滅菌的器械都要滅菌，直尺和marker筆在操作前紫外照射30min(超凈臺內(nèi))
(2)先用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻地劃橫線，大約每隔0.5~1cm一道，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。
(3)在空中加入約5X105個細(xì)胞，具體數(shù)量因細(xì)胞不同而不同，掌握為過夜能鋪滿。
(4)第二天用槍頭比著直尺，盡量垂直于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不要傾斜。
(5)用PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基。
(6)放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。按0、6、12、24小時取樣，拍照。
注意的幾個問題：
1、劃痕前是不倒培養(yǎng)基的，劃痕后再倒掉培養(yǎng)基加PBS清洗后加吳學(xué)謙培養(yǎng)基；
細(xì)胞長到融合成單層狀態(tài)時，在融合的單層細(xì)胞上人為制造一個空白區(qū)域，稱為“劃痕”。劃痕邊緣的細(xì)胞會逐漸進(jìn)入空白區(qū)域使“劃痕”愈合。因此是整個培養(yǎng)皿都加培養(yǎng)基的，觀察部位是劃痕而已。
2、通過算每個視野的劃痕面積，可以通過image J 軟件計算。
3、劃痕法的意義在于，價格低廉，操作簡單。還有很重要的一點在于細(xì)胞外圍環(huán)境簡單單純，容易控制。（比如做加藥的，可能會和血清的組分有反映，而且受血清批次的影響，造成誤差。如果是鋪了ECM物質(zhì)的，組分就更復(fù)雜了。）
.劃痕法測量適用的細(xì)胞范圍較小，一般只適用于上皮細(xì)胞，纖維樣細(xì)胞。因為
a.這些細(xì)胞本身有遷移能力，且較強。
b.細(xì)胞有極性，方便測量，觀察。
c.細(xì)胞對無血清有較強的忍受力（至少24小時），因此很多腫瘤細(xì)胞系是不適合做劃痕的，很多腫瘤細(xì)胞系在無血清培養(yǎng)下，12小時細(xì)胞凋亡就超過50%。這也就是transwell發(fā)展的大要求。而一些上皮樣細(xì)胞系甚至可以忍受高達(dá)72小時的無血清實驗。足以彌合劃痕。
4、其實在傷口彌合中，fibroblast的向創(chuàng)口處遷移就是典型的側(cè)向爬行。但是其實癌細(xì)胞的遷移倒不是側(cè)向爬行那么簡單，我覺得應(yīng)該是綜合效應(yīng)，而且要看是什么類型的腫瘤。因為對于遠(yuǎn)端病灶的轉(zhuǎn)移，顯然是通過血液運輸?shù)?。這是一個細(xì)胞去黏附和再黏附的過程。其實transwell也不能很好的模仿這個過程。只是transwell+matrigel可以模仿腫瘤細(xì)胞融解基質(zhì)，侵入到正常組織的這個過程。也就是侵襲。所以對于做cancer的來說，可能transwell會更好些。但我覺得并不能就簡單否定scar assay。細(xì)胞的遷移作為細(xì)胞的一個正常生理活動，是表征細(xì)胞生理變化的一個重要指標(biāo)。這點是很主要的意義。