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雙熒光素酶檢測實(shí)驗(yàn)步驟
閱讀：4539 發(fā)布時(shí)間：2020-11-3一、細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染
一、實(shí)驗(yàn)方法
1. 培養(yǎng)293T細(xì)胞，待細(xì)胞長滿后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105cells/ml，接種于24孔培養(yǎng)板，每孔500uL，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，觀察細(xì)胞80%粘連。
2. 制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物
A) 用100μl無血清培養(yǎng)基稀釋3’UTR雙熒光素酶報(bào)告基因載體，輕輕混勻；
B) 用100μl無血清培養(yǎng)基稀釋RBP過表達(dá)載體，輕輕混勻；
C) Lipofectamine 2000使用前，輕輕混勻，用100μl無血清培養(yǎng)基稀釋2.5μl Lipofectamine 2000，輕輕混勻，室溫孵育5min；
D) 將A、 B、C的液體加在一起，輕輕混勻，室溫孵育20min，轉(zhuǎn)染復(fù)合物形成。
3. 將24孔板中200μl 培養(yǎng)基，再分別加入300uL上述混合液，每孔終體積為500uL。質(zhì)粒濃度均為500ng/孔，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。
5. 37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4-6h后，吸掉上清液，加入500uL的*培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h后備用。
二、雙熒光報(bào)告基因檢測
2.1 實(shí)驗(yàn)材料
雙熒光檢測試劑盒(promega E1910)
脫色搖床(海門市其林貝爾TS200A)，低溫冷凍離心機(jī) (Sigma 3K15)，發(fā)光檢測儀 (Molecular Devices SpectraMax®i3 )。
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
具體實(shí)驗(yàn)步驟參見試劑盒說明書
裂解細(xì)胞 ：吸盡細(xì)胞培養(yǎng)液后， PBS輕柔漂洗兩次，參考下表加入適量的1×PLB裂解液(用去離子水將5×Passive Lysis Buffer母液稀釋成1×PLB，可在4℃保存1個(gè)月)，室溫?fù)u床放置15min充分裂解后備用。
注：細(xì)胞裂解后可以立即測定，也可以先凍存，待以后再測定。凍存樣品需融解，并達(dá)到室溫后再進(jìn)行測定。
水浴溶解Luciferase Assay Buffer Ⅱ溶液后，加入到1劑量的Luciferase Assay Substrate凍干粉中，充分溶解后分裝成若干小管，儲存在-20℃(≦1個(gè)月)或-70℃(≦1年)，使用前水浴解凍，上下顛倒兩次并恢復(fù)至室溫備用
按照每個(gè)樣本100uL用量，取適量50×Stop & Glo®Reagent，用Stop & Glo®Buffer稀釋成1×Stop & Glo®Reagent，現(xiàn)配現(xiàn)用。
按儀器操作說明書開啟化學(xué)發(fā)光儀或具有檢測化學(xué)發(fā)光功能的多功能酶標(biāo)儀，將測定間隔設(shè)為2秒，測定時(shí)間設(shè)為10秒。
每個(gè)樣品測定時(shí)，取樣品20uL，加入100uL LARⅡ試劑，用槍打勻后測定RLU1(relative light unit)。
加入100uL1×Stop & Glo®Reagent，用槍打勻后測定RLU2(relative light unit)。
2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析