1. 概要

T2毒素（T2）是由多種鐮刀菌產(chǎn)生的一種霉菌毒素。主要污染小麥、大麥、玉米等糧食作物及其制品，對人類健康及畜牧業(yè)構(gòu)成了較大危害。T-2毒素主要影響血液，肝臟，腎臟，胰腺肌肉及淋巴細胞的功能，T-2毒素中毒后的一般臨床癥狀為厭食、嘔吐、腹瀉、生長停滯、繁殖和神經(jīng)機能障礙等。使用T2毒素試劑盒則能夠快速而準確的分析樣品中T2毒素殘留。

1. 原理

測定的基礎(chǔ)是抗原-抗體反應(yīng)。微孔板上包被有偶聯(lián)抗原。分別加入T2毒素標準品或樣品、酶標記物和抗體于微孔中，樣品/標準品競爭結(jié)合抗體，酶標記物可與一抗結(jié)合，再于酶標版上的包被抗原結(jié)合。反應(yīng)洗滌后，加入TMB底物顯藍色，加入終止液后顏色由藍變黃，用酶標儀在450nm處檢測，吸光值與樣品中T2毒素含量成負相關(guān)，與標準曲線比較即可得出T2毒素的含量。

1. 試劑盒的組成

1. 包被有抗原的96微孔板：1塊（96 孔，12條×8 孔）
2. T2毒素標準品：0ng/mL、0.5ng/mL、 1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、20ng/mL                        1 瓶 × 1.0mL
3. T2抗體                      1瓶 ×10mL
4. 酶標記物                    1 瓶 ×10mL
5. 10× 濃縮洗滌液：            1瓶 × 50mL
6. T2稀釋緩沖液A：             1瓶 × 50mL
7. T2稀釋緩沖液B：             1瓶 × 50mL
8. 顯色底物TMB：              1瓶 × 17mL
9. 終止液：                     1瓶 × 7mL
10. 試劑盒說明書：               1份
11. 質(zhì)檢報告：                   1份

1. 需要的儀器、試劑

1）儀器   

1. 酶標儀450nm（iELisa全自動酶標儀或相當者）
2. 微量移液器：20μL-200μL單道，100μL-1000μL單道, 50μL-300μL八道
3. 多功能旋轉(zhuǎn)混合器（或者搖床、高速均質(zhì)器）
4. 酶標板振蕩器
5. 渦旋混合器
6. 50mL離心管
7. 1.5mL離心管
8. 定性濾紙
9. 過濾漏斗
10. —天平：感量0.01g

1. 試劑

1. 樣品提取液70%甲醇：取700mL甲醇，加300mL純水，混勻。

1. 樣品處理

5.1谷物（玉米、小麥、高粱、大米、大豆）：

1. 稱取5.0g粉碎樣品于50mL離心管中，加入25.0mL樣品提取液70%甲醇,置于多功能旋轉(zhuǎn)混合器上振蕩30分鐘（或使用高速均質(zhì)器均質(zhì)3分鐘，或搖床上振蕩40分鐘）。
2. 將提取液用普通濾紙過濾，吸取100μL濾液置于1.5mL離心管中，加入900μL T2稀釋緩沖液A，用渦旋混合器混勻。

稀釋倍數(shù)：50

5.2飼料：

1. 稱取5.0g粉碎樣品于50mL離心管中，加入25.0mL樣品提取液70%甲醇,置于多功能旋轉(zhuǎn)混合器上振蕩30分鐘（或使用高速均質(zhì)器均質(zhì)3分鐘，或搖床上振蕩40分鐘）。
2. 將提取液用普通濾紙過濾，用0.22μm有機系濾膜過濾后，取100μL濾液置于1.5mL離心管中，加入900uL T2稀釋緩沖液B，用渦旋混合器混勻。

稀釋倍數(shù)：50

6． 酶聯(lián)免疫分析程序

6.1測定之前注意事項

1. 使用前將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）。
2. 使用后迅速將試劑放入2-8℃冷藏。
3. 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
4. 所有溫育過程應(yīng)避免陽光直射，并按要求用蓋板覆蓋住酶標板。

6.2溶液的配制

1. 提取液的配制: 根據(jù)實驗所需的量配制70%的甲醇水溶液（水要用純水、或蒸餾水、去離子水）
2. 洗滌液的配制：將濃縮洗滌液用純水稀釋10倍后使用。（例如：取10 mL 濃縮液+90 mL純水, 可以用于32孔的檢測）。

6.3測定程序

1. 將足夠標準品和樣品所用數(shù)量的孔條插入酶標板架，標準品和樣品做兩個平行實驗，記錄下標準和樣品的位置。未使用的酶標板用鋁箔袋封好置2-8℃冷藏保存。
2. 分別吸取50μL標準品和樣品加至相應(yīng)的微孔（雙孔）中，然后再各加入50μL的酶標記物，后加入50μL的T2抗體，裝入袋中密封，室溫（25℃）溫育20分鐘。
3. 倒出孔中的液體，每孔加入250μL稀釋好的洗滌液洗滌，重復操作四次。洗板時每次間隔30s，洗完后用力在吸水紙上排干。
4. 每孔加入100μL顯色底物，避光室溫（25℃）溫育10分鐘。
5. 每孔加入50μL終止液，混勻。
6. 置于酶標儀中，振蕩混勻，在450nm處測定吸光度值（OD值），參比波長630nm。（iELisa全自動酶標儀可以直接讀出、打印濃度值）。

7.  結(jié)果判定

1）所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以DI個標準（0標準）的吸光度值（B<蘇b>0）再乘以*，即百分吸光度值。

以T2毒素標準品濃度值（ppb）為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線圖。相對應(yīng)每一個樣品的濃度可以從標準曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計算出樣本溶液濃度。利用計算機專業(yè)軟件，更便于大量樣品的快速分析。

1. 樣品的實際濃度為讀數(shù)結(jié)果乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
2. 如果測定值超出檢測范圍，樣品提取溶液按一定的比例用70%甲醇進行稀釋。

8.  注意事項

1. 室溫低于20℃或試劑及樣品未回到室溫（20- 25℃）會導致數(shù)值偏低。
2. 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥過久的情況，則會出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板排干后應(yīng)立即進行下一步操作。
3. 標準物質(zhì)和顯色液對光敏感，避免直接暴露在光線下。
4. 混合要均勻，洗板要*（包括加樣品和標準液的時候都必需充分混合均勻）。
5. 終止液為強酸性物質(zhì)，避免接觸皮膚。
6. 不要使用過了有效期的試劑盒，也不要混合使用不同批次的試劑盒，這樣會引起測定結(jié)果不準確。
7. 試劑盒的儲存條件是2-8℃，切勿冷凍。

9.  試劑盒的性能指標

1. 檢測限LOD: 谷物10ppb(μg/kg)，飼料15ppb，（LOD：空白樣品測定值+2倍標準偏差SD）
2. 定量限LOQ: 谷物25ppb，飼料30ppb。
3. 定量檢測范圍：谷物25-1000ppb，飼料30-1000ppb。