實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)中常見(jiàn)問(wèn)題匯總
實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)（real-time PCR）也叫qPCR（Quantitave PCR），是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)特定數(shù)學(xué)原理對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。它是一項(xiàng)臨床上非常成熟的技術(shù)，目前在分子生物學(xué)領(lǐng)域，qPCR核酸定量的主要方法。目前仍在全球肆虐的病毒鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)"——核酸檢測(cè)就是通過(guò)qPCR原理進(jìn)行的。
那么拿到一個(gè)樣本，需要經(jīng)過(guò)以下多項(xiàng)操作流程才能定量檢測(cè)到它的核酸含量。其中任何一個(gè)步驟操作失誤都會(huì)導(dǎo)致它的檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)異常！
1、無(wú)Ct值出現(xiàn)
a) 檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤：一般染料法采用72℃延伸時(shí)采集，探針?lè)▌t一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸結(jié)束采集信號(hào)。
b) 引物或探針降解：可通過(guò)PAGE電泳檢測(cè)其完整性。
c) 模板量不足：對(duì)未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起。
d) 模板降解：避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況。
e) 反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠：一般都要在35個(gè)循環(huán)以上，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況增加循環(huán)，但高于45個(gè)循環(huán)會(huì)增加過(guò)多的背景信號(hào)。
2、Ct值出現(xiàn)過(guò)晚
a) 擴(kuò)增效率極低：優(yōu)化反應(yīng)條件，嘗試三步法擴(kuò)增程序，或者重新設(shè)計(jì)引物。
b) 模板濃度太低：減少稀釋度，重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
c) 模板降解：重新制備模板，重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
d) PCR產(chǎn)物太長(zhǎng)：一般將PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度設(shè)計(jì)為100 bp-200 bp之間。
e) 反應(yīng)體系中存在PCR反應(yīng)抑制劑：一般為加入模板時(shí)帶入，導(dǎo)致模板質(zhì)量不高，加大模板稀釋倍數(shù)或者重新制備模板重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
3、陰性對(duì)照出現(xiàn)明顯擴(kuò)增
a) 反應(yīng)體系組分（如水）被污染：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，更換新的Mix或者水重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
b) 標(biāo)本間的交叉污染或產(chǎn)物污染：反應(yīng)體系在超凈工作臺(tái)內(nèi)配制，對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行嚴(yán)格的區(qū)分，減少氣溶膠污染；使用帶濾芯的槍頭。
c) 引物二聚體的出現(xiàn)：引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。
d) 引物濃度不佳：適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。在35循環(huán)后陰性對(duì)照出現(xiàn)擴(kuò)增屬正常情況，可配合熔解曲線(xiàn)進(jìn)行分析。
4、熔解曲線(xiàn)出現(xiàn)多峰
a) 非特異性擴(kuò)增。
b) 引物設(shè)計(jì)不佳：避免二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。
c) 引物濃度不佳：適當(dāng)調(diào)整引物濃度。
d) 退火溫度低：提高退火溫度。
e) 模板中有基因組DNA的污染：RNA提取過(guò)程中避免基因組DNA的污染（DNaseI處理），或通過(guò)設(shè)計(jì)引物避免非特異性擴(kuò)增。
5、出現(xiàn)引物二聚體
a) 優(yōu)化擴(kuò)增條件，如提高退火溫度，可利用梯度PCR，摸索最佳的Tm值。通常兩步循環(huán)(由95℃變性步驟直接進(jìn)入60℃退火和延伸步驟)有利于強(qiáng)效擴(kuò)增，因此引物設(shè)計(jì)時(shí)設(shè)定的成功退火溫度為60°C。
b) 引物濃度太高，適當(dāng)降低引物濃度。
c) 可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)引物二聚體。引物二聚體在凝膠的底部形成擴(kuò)散條帶，通常位于100 bp以下。
6、擴(kuò)增效率低
a) 反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解。
b) 反應(yīng)條件不佳：適當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴(kuò)增法。
c) 反應(yīng)體系中有抑制物：一般為模板中引入，應(yīng)先把模板適當(dāng)稀釋?zhuān)偌尤氲襟w系中，減少抑制物的影響。
7、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差
a) 加樣體積失準(zhǔn)：使用性能較好的移液槍?zhuān)瑪U(kuò)大反應(yīng)體積，將模板做高倍稀釋?zhuān)源篌w積加入反應(yīng)體系中。
b) 定量PCR儀不同位置溫度控制不一致：定期校準(zhǔn)儀器。
c) 模板濃度太低：模板濃度越稀，重復(fù)性越差，減少模板稀釋度或提高加樣體積。
d) qPCR mix沒(méi)有混勻，請(qǐng)使用前充分混勻。
蘇州阿爾法生物提供的PCR儀系列主要有A100基因擴(kuò)增儀、A200PCR儀、A300快速PCR儀、A600梯度PCR儀、T20PCR儀、Q2000B高通量熒光定量PCR儀、便攜式PCR儀等。
