在生物制藥領域，單細胞克隆篩選是藥物研發(fā)的關鍵步驟之一。FujiFilm Diosynth Biotechnologies公司是一家專注于生物制藥研發(fā)的公司，他們面臨著快速產生高產單細胞克隆的挑戰(zhàn)。為了應對這一挑戰(zhàn)，FujiFilm Diosynth Biotechnologies采用了Cell Metric高分辨率孔板成像系統(tǒng)，開發(fā)了一種快速產生高產單細胞克隆并保證高概率和高單克隆源性的新工作流程。本文將詳細介紹使用Cell Metric高分辨率孔板成像系統(tǒng)進行單細胞克隆篩選的相關工藝開發(fā)流程：

 1. 單細胞包裹到油基微滴中

這一步驟的實施主要是通過將細胞與油基微滴混合，使細胞均勻分布在微滴中。油基微滴的大小通常在幾百微米左右，這樣可以確保每個微滴中只包含一個細胞。將單細胞包裹到油基微滴中后，細胞會在微滴中生長，并表達感興趣的基因。

2. 基于FRET信號分選高產克隆

基于FRET信號分選高產克隆是利用熒光共振能量轉移（FRET）技術來篩選高產克隆。FRET是一種熒光信號的傳遞方式，當兩個熒光團距離足夠近時，能量可以從發(fā)射能量高的熒光團轉移到發(fā)射能量低的熒光團。在單細胞克隆篩選中，通常將一個熒光團標記在感興趣的基因上，另一個熒光團標記在細胞的表面或內部。當兩個熒光團距離足夠近時，FRET信號會被檢測到。通過檢測FRET信號，可以篩選出高產克隆。

3. 使用Cell Metric進行成像以驗證單克隆源性

使用Cell Metric高分辨率孔板成像系統(tǒng)進行成像以驗證單克隆源性。Cell Metric成像系統(tǒng)提供超高分辨率成像，達到2um/像素，能夠清晰展示細胞細節(jié)，確保成像質量。激光對焦技術確保每個細胞孔都得到準確成像，避免虛焦和遺漏微孔信息。

具體應用如下：

- Day 0細胞成像：在Day 0時，使用Cell Metric®對細胞板進行拍照，記錄每個孔的細胞狀態(tài)。

- Day 1和Day 2細胞成像：在Day 1和Day 2時，再次使用Cell Metric成像系統(tǒng)對細胞板進行拍照，記錄每個孔的細胞分裂情況。

- Day 7成像：在Day 7時，使用Cell Metric對細胞板進行拍照，記錄每個孔的克隆形成情況。

通過Cell Metric成像，可以確認約200-300個克隆有著高滴度值，并選擇至少50個滴度MAX高的單細胞擴增克隆。這種單細胞克隆的確認是非常嚴格的，并需要生成相關報告用于提交IND。

 4. 克隆擴增

使用先前同樣的方法，從靜態(tài)培養(yǎng)到搖瓶培養(yǎng)進行擴增。另用一個30mL搖瓶補料分批培養(yǎng)，將高表達克隆繼續(xù)擴增。

5. 克隆評價

基于細胞生長和滴度測試來最終確定哪些克隆被送到生產部門，并還需要將細胞培養(yǎng)上清進行純化交到分析部門，進行蛋白質量檢測——CE-SDS（毛細管電泳-SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳），HPLC-SEC（高效液相-尺寸排阻色譜），CIEF（等電毛細聚焦），結合和功能測試。他們同樣要檢測拷貝數，檢測支原體。

 6. 產量分析

結果中挑選了8個產量高的克隆送去生產部門，進行3L生物反應器發(fā)酵，進行活細胞密度（VCD）和IgG產量分析。

 7. 產生候選克隆

將品質較高的候選克隆被挑選出來，創(chuàng)建研究細胞庫（RCB）。

通過Cell Metric高分辨率孔板成像系統(tǒng)，使FujiFilm Diosynth Biotechnologies公司能夠快速、高效地篩選出高產單細胞克隆，并保證其高概率和高單克隆源性。這種集成化平臺能夠縮短細胞系開發(fā)時間，并提供高通量、快速而溫和的細胞包裹、靈敏度高的定量分析、單細胞克隆衍生的視覺驗證、高產單個細胞向微孔板中的自動分配。

通過這個平臺，FujiFilm DDiosynth Biotechnologies公司能夠更有效地推動其生物制藥研發(fā)進程。Cell Metric®的高分辨率成像能力和對焦技術的精確性，使得科學家能夠從大量細胞中快速識別出單克隆細胞，從而節(jié)省了時間和資源。

Cell Metric細胞成像系統(tǒng)主要具有以下特點：

 1.實時監(jiān)測和分析

Cell Metric配套軟件允許科學家實時監(jiān)控細胞在微池中的生長情況，以及克隆的形成和生長情況。這有助于及時發(fā)現和排除不表達的細胞微池，提高篩選的準確性。同時，科學家可以利用軟件中的分析工具，對圖像進行處理和分析，以獲得更多關于細胞生長和克隆形成的信息。

2.自動化的數據記錄和報告功能

Cell Metric細胞成像系統(tǒng)能夠自動記錄每個孔的整孔成像，包括接種細胞的具體位置和細胞隨時間分裂和生長的情況。這些數據可以被用于生成詳細的單克隆報告，記錄每個克隆的生長情況，以及它們的產量和表達水平。這些報告對于提交給監(jiān)管機構來說是重要的，因為它們證明了細胞系的單克隆源性。

3.高效篩選和驗證

通過結合Cyto-Mine微流控單細胞分析篩選系統(tǒng)和Cell Metric高分辨率孔板成像系統(tǒng)，FujiFilm Diosynth Biotechnologies公司能夠實現單細胞克隆的高效篩選和驗證。這種集成化平臺能夠提供高通量、快速而溫和的細胞包裹、靈敏度高的定量分析、單細胞克隆衍生的視覺驗證、高產單個細胞向微孔板中的自動分配。

4.質量控制和合規(guī)性

Cell Metric系統(tǒng)能夠直接生成單克隆報告，滿足政策法規(guī)中關于細胞單克隆源性的要求，并縮短篩選周期。高質量成像結果可以作為證據文件提交給監(jiān)管部門，用以證明細胞系來源于單個細胞祖先。

    總的來說，Cell Metric高分辨率孔板成像系統(tǒng)及一體化集成平臺不僅提高了篩選的速度，還確保了篩選的準確性，成為生物制藥公司的新藥開發(fā)、抗體篩選等工藝生產的重要實驗室儀器設備。更多的實驗室儀器、實驗耗材、實驗試劑可以進入蘇州阿爾法生物