微量熱泳動(dòng)儀-microscale thermophoresis (MST)是由總部設(shè)在慕尼黑的德國高科技公司NanoTemper技術(shù)有限公司發(fā)明的設(shè)備。2010年底的一篇Nautre的文章《Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis》報(bào)道了NanoTemper公司創(chuàng)始人Dr. Stefan和 Dr. Philipp使用MST測量生物溶液中蛋白-蛋白之間的相互作用，引起了很多科研人員的興趣。隨后這個(gè)產(chǎn)品正式投入市場，在2011年就有很多客戶購買試用，2012年就有130個(gè)國外的實(shí)驗(yàn)室購買使用。而且在短短的一年多的時(shí)間內(nèi)，相關(guān)數(shù)據(jù)已經(jīng)發(fā)表到nature，cell，PNAS等期刊，大大受到用戶們的歡迎。
MST背景技術(shù)介紹
微量熱泳動(dòng)是粒子在微觀的溫度梯度中的定向運(yùn)動(dòng)。通過測量水化層的變化（通常是由生物分子結(jié)構(gòu)/構(gòu)象的變化引起的）而導(dǎo)致的微量熱泳動(dòng)的變化來確定親和力。甚至像蛋白質(zhì)磷酸化或小分子結(jié)合到靶標(biāo)上這些微小的變化都可以被測量到。MST也允許直接在溶液中測量分子間相互作用，而不需要一個(gè)固定的表面（無需固定）。MST是由總部設(shè)在慕尼黑的德國高科技公司NanoTemper技術(shù)有限公司發(fā)展出來的。
微尺度熱泳（MST）是一種新的方法，可以定量分析溶液中微升的分子間的相互作用。MST是基于微量熱泳動(dòng)效應(yīng)，即沿溫度梯度定向的分子運(yùn)動(dòng)。一個(gè)空間的溫度差ΔT導(dǎo)致分子濃度在溫度升高的地區(qū)的變化，用Soret系數(shù)ST定義為：C熱/C冷= EXP（-STΔT）。
熱泳動(dòng)取決于分子和溶劑之間的界面。在恒定的緩沖條件下，熱泳動(dòng)反映出分子大小，電荷和溶劑化熵。 一個(gè)熒光標(biāo)記分子A的熱泳動(dòng)由于大小、電荷和溶劑化熵的差異通常明顯不同于分子A和靶標(biāo)T形成的復(fù)合物AT。這種熱泳動(dòng)的區(qū)別可以用來通過梯度滴定實(shí)驗(yàn)，在一定緩沖條件下，測量計(jì)算出分子間的結(jié)合常數(shù)。
測量熒光標(biāo)記分子的熱泳運(yùn)動(dòng)是通過監(jiān)測毛細(xì)管內(nèi)的熒光分布F。紅外激光產(chǎn)生微觀的溫度梯度。溶液在激光光斑處的溫度升高ΔT= 5 K，之前的紅外激光是在同質(zhì)化的熒光分布F是毛細(xì)管內(nèi)觀察到的冷切換。當(dāng)紅外激光打開后，兩方面因素影響熒光的分布（熱弛豫時(shí)間和熒光標(biāo)記分子的熱泳動(dòng)），但是由于其時(shí)間尺度分離（熱弛豫時(shí)間很短和熒光標(biāo)記分子的熱泳動(dòng)時(shí)間較長），有利于我們測量熒光分布F熱。在較慢的熱泳動(dòng)時(shí)間內(nèi)（10秒），分子運(yùn)動(dòng)從局部加熱區(qū)域移往四周的低溫地區(qū)，中心區(qū)域的分子濃度降低，由于質(zhì)量擴(kuò)散效應(yīng)的反作用，后分子的分布直到達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定態(tài)。
雖然質(zhì)量擴(kuò)散D的決定消耗的動(dòng)力學(xué)，S、T確定的穩(wěn)態(tài)濃度比例下溫度上升Chot/Ccold=exp(-ST ΔT) ≈ 1-STΔT。歸一化熒光Fnorm= F熱/ F冷主要是這個(gè)濃度比，除了溫度跳躍∂F /∂T的線性近似，我們發(fā)現(xiàn)：Fnorm= 1 +（∂F /∂TST）的溫差。由于熒光強(qiáng)度的線性和熱泳枯竭，F(xiàn)norm（A）未結(jié)合的分子歸熒光和約束復(fù)雜的Fnorm（AT）線性疊加。 表示x的綁定到目標(biāo)分子的一小部分，在目標(biāo)T滴定的熒光信號不斷變化的計(jì)算公式如下：Fnorm=(1-x) Fnorm(A)+x Fnorm(AT)。
定量綁定參數(shù)獲得通過的約束力基板的連續(xù)稀釋。通過繪制F規(guī)范對系列稀釋的不同濃度的對數(shù)，獲得一個(gè)S形的結(jié)合曲線。這種結(jié)合曲線，可以直接安裝質(zhì)量作用定律的非線性解與解離常數(shù)K ð，作為結(jié)果。微量熱泳（MST）是一種分析生物分子的技術(shù)。微尺度熱泳是粒子在微觀的溫度梯度中的定向運(yùn)動(dòng)。
實(shí)驗(yàn)流程
很簡單的實(shí)驗(yàn)方法，使用便宜的毛細(xì)吸管作為耗材，避免了昂貴的樣品消耗和繁瑣的制備過程。相對于其他的已有的測量分子間相互作用的技術(shù)，MST結(jié)合毛細(xì)管使用大大降低所需的實(shí)驗(yàn)成本，并且可以測量天然狀態(tài)環(huán)境中的生物分子間的相互作用。
熒光分子的濃度的保持不變而結(jié)合物分子的濃度梯度增加。將6ul的樣品量被填充在MST毛細(xì)血管，然后使用制造一個(gè)局部溫度梯度。由于標(biāo)記分子在玻璃毛細(xì)管中的運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的區(qū)域熒光強(qiáng)度變化就會(huì)被觀測到。既可用標(biāo)記的熒光染料/融合表達(dá)的熒光蛋白來發(fā)光(NT.115系統(tǒng))，也可以用色氨酸自發(fā)熒光來檢測(NT.LabelFree系統(tǒng))。通過檢測不同濃度的結(jié)合物分子對熒光分子熱泳動(dòng)平衡態(tài)的分布的影響，從而獲得這兩個(gè)分子間相互作用的各種參數(shù)。
熒光分子初是自由均勻分布的。在紅外激光照射下，分子受到熱泳動(dòng)的作用力，從加熱區(qū)域向低溫區(qū)域移動(dòng)，同時(shí)分子又受到濃度梯度和質(zhì)量擴(kuò)散力的作用，后分子在熱泳動(dòng)作用力和質(zhì)量擴(kuò)散作用力下達(dá)到平衡，形成穩(wěn)定態(tài)。在關(guān)閉紅外激光后，分子擴(kuò)散重建均勻分布狀態(tài)。下圖顯示了該過程。
主要特點(diǎn)
樣品處理方面：
☆ 不需要固定，在生物溶液中測量，無需純化
☆ 無需標(biāo)記測量
☆ 使用熒光染料/熒光蛋白具有良好的選擇性
☆ 極低的樣品消耗量
☆ 直接在脂質(zhì)體或者去污劑中研究膜蛋白
☆ 研快速簡單的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
測量數(shù)據(jù)方面：
☆ 10分鐘之內(nèi)測量任何（生物）分子間親和力(KD, 解離常數(shù))
☆ 測量sub-nM到mM 級的解離常數(shù)
☆ 可以選擇特定溫度下完成測量
☆ 研究各種不同大小的分子：離子、片段、核小體、脂質(zhì)體
☆ 可以在各種不同的溶液環(huán)境中完成測量，包括研究膜蛋白所需的復(fù)雜的去污劑環(huán)境
☆ 廣泛的樣品兼容性：天然的環(huán)境中、生理學(xué)實(shí)驗(yàn)條件、血清、細(xì)胞裂解液
☆ 可以研究多組分反應(yīng)：三元復(fù)合物、裝配順序、干擾因素、協(xié)同作用、類似物
☆ 可以區(qū)分靶標(biāo)上不同的結(jié)合位點(diǎn)
☆ 可以測量生物分子的寡聚化
☆ 研究化學(xué)計(jì)量學(xué)并確定生物分子結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目
☆ 研究結(jié)合能量學(xué)ΔG (自由能 )，ΔH (焓) 和ΔS (熵)
☆ 研究蛋白的折疊和穩(wěn)定性
實(shí)驗(yàn)操作方面：
☆ 非常簡單易操作
☆ 實(shí)時(shí)獲得數(shù)據(jù)
☆ 非常穩(wěn)定的技術(shù)
維護(hù)費(fèi)用方面：
☆ 非常低的運(yùn)行成本
☆ 不需要日常的儀器維護(hù)
☆ 更快得到數(shù)據(jù)用于發(fā)表文章
☆ 儀器小型化設(shè)計(jì)，占用空間少
分子間相互作用分析技術(shù)---微量熱泳動(dòng)儀（MST）
您好, 歡迎來到化工儀器網(wǎng)
