比塞勒準(zhǔn)備工作

時(shí)間：2024/1/17閱讀：675

緩沖

制備 Bicelles 的一種有效且方便的方法是使用含有 10mM 磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）、0.15 mM N3Na、93% H2O（HPLC 級）、7% D2O (99.9%) 的緩沖溶液。下面，將該溶液簡稱為緩沖液。

比塞勒地層

總共含有 15% w/v（150mg 脂質(zhì)/ml）的 DMPC/DHPC 儲備溶液制備如下：

將緩沖液添加到凍干脂質(zhì)混合物中。 50 mg 脂質(zhì)混合物，280 mg 緩沖液 200 mg 脂質(zhì)混合物，1130 mg 緩沖液
讓混合物在室溫（18-220°C）下水合幾個(gè)小時(shí)。 “q"為 2.8 – 3.0 的脂質(zhì)混合物，水合作用在 2 – 3 小時(shí)內(nèi)完成。“q"為 3.25 – 3.5 的脂質(zhì)混合物需要 24 小時(shí)才能全部水合。可以通過將任何混合物加熱至 40°C 10 分鐘并循環(huán)至 18°C 兩次，然后短暫渦旋來實(shí)現(xiàn)加速水合（一小時(shí)）。

蛋白質(zhì)-Bicelle 混合物

將兩體積的蛋白質(zhì)溶液添加到一體積的 bicelle 溶液中。

二元磷脂顆粒 (Bicelles) 全部改變了核磁共振大分子結(jié)構(gòu)分析

水溶性蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的測定

Tjandra 和 Bax (1) 最近開發(fā)了一種新的核磁共振 (NMR) 技術(shù)，可以在液晶浴中輕輕排列蛋白質(zhì)分子，使研究人員能夠確定相鄰原子之間的每個(gè)鍵相對于分子其余部分的取向。通過編譯原子之間的所有此類方向，可以得出蛋白質(zhì)的精確圖譜。在略高于室溫的水溶液中，脂質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)變?yōu)橐壕?(LC) 相，形成圓盤狀顆粒，通常稱為 bicelles (2)，直徑為數(shù)百埃，厚度約為 40? 。脂質(zhì)是抗磁性的，因此，bicelles 的方向與其法向正交于磁場。然而，這些樣品的壽命和取向溫度范圍很大程度上取決于樣品成分和實(shí)驗(yàn)條件。Losonczi 和 Prestegard (3) 證明，用少量帶電兩親物摻雜稀釋的 bicelle 溶液可顯著提高穩(wěn)定性和排列程度，并擴(kuò)大這些系統(tǒng)的取向溫度范圍。

基于膠體的 DLVO 理論，提出了 bicelle 聚集對樣品成分依賴性的解釋。Crowell 和 Macdonald (4) 在 25-50°C 的溫度范圍內(nèi)使用固態(tài)磷 (31P) 和氘 (2H) NMR 光譜來研究由 1,2-二肉豆蔻?；?sn-Glycero-3- 組成的雙層膠束 (bicelles)磷酸膽堿 (DMPC) 和 1,2-二己?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿 (DHPC)，存在陰離子脂質(zhì) 1,2-二肉豆蔻?；?sn-甘油-3-磷酸甘油 (DMPG) 或陽離子脂質(zhì) 1 時(shí),2-二肉豆蔻?；?3-三甲基丙烷銨 (DMTAP)。31P-NMR譜表明，當(dāng)DMPG/DMPC比例為0至50/50以及DMTAP/DMPC比例為0至40/60時(shí)，形成雙胞結(jié)構(gòu)，而DHPC的總濃度保持恒定。含有帶電兩親物的雙分子團(tuán)的形成取決于 NaCl 的存在，50 mM NaCl 足以在所研究的所有帶電兩親物濃度下形成雙分子團(tuán)，而 150 mM NaCl 可為各種 31PNMR 共振信號提供更好的分辨率。2H-NMR 譜表明，頭基氘化 DMPC 的四極分裂 Dv 作為存在的負(fù)電荷與正電荷數(shù)量的函數(shù)成反比變化，并且 α-碳上的氘核的變化與 α-碳上的氘核的變化在意義上相反。 β-碳。這表明頭基氘代磷脂酰膽堿在 bicelles 中充當(dāng)分子電壓計(jì)，其方式與球形囊泡中的作用大致相同。

PH值穩(wěn)定的Bicelles

為了提高 Bicelles 在較寬 pH 范圍內(nèi)的穩(wěn)定性，Ottiger & Bax (5) 證明，二十四烷基磷脂酰膽堿 (14-O-PC) 或二十二烷基磷脂酰膽堿 (12-O-PC) 和二己基磷脂酰膽堿 (6-O-PC) 的混合物水在與先前報(bào)道的由 DMPC 和 DHPC 組成的 bicelle 類似的條件下形成溶致液晶相。DMPC 和 DHPC 中存在的羧酸酯鍵被其烷基類似物中的醚鍵取代，這防止了這些化合物的酸或堿催化水解。在 2.3-10.4 pH 范圍內(nèi)測量泛素的 15N-1H 偶極耦合表明，該蛋白質(zhì)在整個(gè)范圍內(nèi)保留了與其在 pH 6.5 時(shí)的結(jié)構(gòu)非常相似的骨架構(gòu)象。此外，卡瓦涅羅等人。(6) 制備并表征了由 1,2-Di-O-十二烷基-sn-甘油-3-磷酸膽堿 (DIODPC) 和 3-(ChlorAmidoPropyl)-二甲基銨-2-羥基-1-丙烷磺酸鹽組成的新型 Bicelle 系統(tǒng)（查普索）。在 4.3:1 的最佳 DIODPC/CHAPSO 摩爾比下，該介質(zhì)從 pH 6.5 變?yōu)榇判匀∠蛑?pH 1.0。與之前報(bào)道的酰基磷脂 bicelle 制劑不同，這些 bicelle 在低 pH 下化學(xué)穩(wěn)定，并且能夠誘導(dǎo)蛋白質(zhì)排列，如在 pH 2.1 下測量的來自氧化亞鐵硫桿菌的銹花青素的大殘余偶極耦合所說明的。DIODPC/CHAPSO 系統(tǒng)特別適用于測量需要強(qiáng)酸性條件的大分子的殘余偶極耦合。

脂溶性蛋白結(jié)構(gòu)的測定

斯特魯普等人。(7) 研究了 Myr-d27-GNAAAAKKGSEQES (Cat14) 的氘核磁共振譜，該肽是來自 cAMP 依賴性蛋白激酶 A (PKA) 催化亞基的 N 端 14 個(gè)殘基肽，以說明中性和酸性磷脂如何磁性排列bicelles 可用于表征肽與膜結(jié)合的順序和模式。由于 Cat14 是電中性的，因此負(fù)責(zé)結(jié)合的主要相互作用是將肉豆蔻?；迦腚p層的疏水核心。磷脂酰膽堿 DMPC:DHPC bicelles 中包含 25% 磷脂酰絲氨酸 (DMPS) 或磷脂酰甘油 (DMPG) 會導(dǎo)致肽的排序相對于正常 bicelle 適度增加，可能是因?yàn)榱字^基與兩者之間有利的靜電相互作用賴氨酸位于第 7 和第 8 位。通過仔細(xì)調(diào)整脂質(zhì)組成、pH 和離子強(qiáng)度，成功制備了酸性 bicelles。普羅瑟等人。(8) 開發(fā)了一種新的與鐿絡(luò)合的磷脂螯合物 (DMPE-DTPA:Yb3+)，它被證明可以很容易地融入模型膜系統(tǒng)中，然后可以在磁場中對齊，使得平均雙層法線位于磁場中。這種所謂的正序近晶相，其脂質(zhì)由低于 1% DMPE-DTPA:Yb3+ 組成，非常適合通過固態(tài) NMR、低角度衍射和需要定向樣品的光譜技術(shù)進(jìn)行膜蛋白結(jié)構(gòu)研究。螯合物 DMPE-DTPA:Yb3+ 與鑭系元素離子牢固結(jié)合，并用于在磁場中定向膜，防止直接的鑭系元素與蛋白質(zhì)相互作用，并顯著減少順磁位移和譜線展寬。正向排列的鑭系元素螯合膜的很大好處在于其在大型固定膜蛋白研究中的應(yīng)用。類似的低自旋鑭系元素螯合物可應(yīng)用于水溶性蛋白質(zhì)的場有序溶液核磁共振研究以及新的磁性排列液晶相的設(shè)計(jì)。

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