各位奮戰(zhàn)在科研前線的戰(zhàn)友們，你們是否曾在凌晨三點的細(xì)胞房里，在顯微鏡下盯著細(xì)胞培養(yǎng)瓶里可疑的那些小黑點，糾結(jié)這到底是細(xì)胞碎片還是污染，這細(xì)胞還能做實驗嗎？事實上，細(xì)胞碎片和微生物污染都有其明顯的特征，了解這些特征，我們就能夠簡單有效地將它們區(qū)分開。
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細(xì)胞內(nèi)黑點和細(xì)胞外黑點的區(qū)分
細(xì)胞內(nèi)黑點：首先需要明確的是，細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒既不是碎片也不是污染，是細(xì)胞器及細(xì)胞外分泌泡，屬于細(xì)胞自身的結(jié)構(gòu)及特性。不同類型的細(xì)胞，胞內(nèi)顆粒的數(shù)量可能不同。培養(yǎng)條件也會影響細(xì)胞內(nèi)顆粒的數(shù)量。
▲ 細(xì)胞內(nèi)黑色顆粒為自身結(jié)構(gòu)特性
細(xì)胞外黑點：通常為細(xì)胞碎片、細(xì)胞代謝產(chǎn)物或血清中的磷酸鈣沉淀（此文中統(tǒng)稱為碎片），常常與污染混淆。
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常見的細(xì)胞培養(yǎng)微生物污染類型
最常見的微生物污染為細(xì)菌、真菌、支原體污染。真菌與碎片差別很大，真菌通常為白色圓球狀或白色菌絲狀，碎片是小黑點，不難區(qū)分。
▲ 真菌污染的兩種典型特征
而支原體用光學(xué)顯微鏡是看不見的，必須要用PCR等實驗手段進(jìn)行檢測。在此不做贅述。
然而，細(xì)菌（特別是球狀細(xì)菌）與碎片卻極為相似，顯微鏡下呈現(xiàn)為小黑點，分布于細(xì)胞周圍。區(qū)分細(xì)菌和碎片則是此文的重點。
03
從形態(tài)、運動和增殖特點區(qū)分碎片和細(xì)菌
4倍或10倍物鏡觀察，可以初步判斷黑點分布情況，但看不清形態(tài)，不容易判斷。所以我們首先要將物鏡調(diào)到20或40倍，再進(jìn)一步觀察黑點的特征。主要從三個方面來判斷：1. 形態(tài)特點 2. 運動方式 3. 是否增殖。
● 看形態(tài)
碎片通常是不規(guī)則的，有圓形有多邊形，大小不一，分布不均勻。細(xì)菌形態(tài)規(guī)則，呈桿狀、球狀或線狀，具有高度重復(fù)性，分布較為均勻。
▲ 左：細(xì)胞碎片 右： 細(xì)菌污染
● 看運動
碎片可分為貼壁或懸浮兩種狀態(tài)：貼壁的碎片不會自主運動，而懸浮的細(xì)胞碎片會隨液體輕微震動或緩慢飄動（越小的碎片越容易震動，震動頻率越高）。
細(xì)胞碎片或分泌物是細(xì)胞在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的，正常培養(yǎng)過程中細(xì)胞代謝和死亡無可避免，大多細(xì)胞系都會有類似情況，只是不同細(xì)胞系碎片顆粒多少會有區(qū)別。顆粒會動是基于高中時期所學(xué)基本物理原理-布朗運動，根據(jù)其他細(xì)胞庫細(xì)胞照片情況，只要拍攝比較清晰的，都可以看到細(xì)胞外黑色顆粒,這些碎片只要是懸浮在液體里都會做布朗運動。JCRB細(xì)胞庫延時攝影信息可以更明顯觀測到碎片位置變化，是布朗運動的時間積累結(jié)果。
▲ 細(xì)胞生長延時攝影（來源：JCRB細(xì)胞庫）
細(xì)菌不會貼壁，無鞭毛的細(xì)菌不會運動；有鞭毛的細(xì)菌會定向游動、原地打轉(zhuǎn)、震動，細(xì)菌這幾種運動方式經(jīng)常是同時存在的。細(xì)菌相比于碎片，運動速度要快得多，運動幅度也會更大。
▲ 碎片隨著液體輕微震動
▲ 細(xì)菌快速運動
● 看增殖
碎片不會增殖，但細(xì)胞逐漸死亡或細(xì)胞密度增大，碎片都會逐漸增多。隨著培養(yǎng)時間延長，培養(yǎng)基中的血清也會緩慢析出沉淀，導(dǎo)致黑點變多。但培養(yǎng)基不會渾濁。
現(xiàn)在我們大部分時候培養(yǎng)細(xì)胞都會加1%青鏈霉素雙抗（也稱為P/S）預(yù)防細(xì)菌污染，然而有一些細(xì)菌不在P/S抗菌譜中，一旦落入培養(yǎng)基就會開始增殖。
大部分細(xì)菌會在1-2天內(nèi)爆發(fā)式生長，導(dǎo)致培養(yǎng)基渾濁，肉眼可見流沙狀物質(zhì)。
也有少數(shù)種類細(xì)菌會受到雙抗的影響，增殖速度沒那么快。當(dāng)比較難判斷的時候，我們可以使用不含雙抗的培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，觀察黑點的增殖情況。
▲ 細(xì)菌污染導(dǎo)致培養(yǎng)基渾濁
04
涂平板菌檢
如果通過以上三種方法還是難以判斷，還有一招——將培養(yǎng)上清涂布細(xì)菌培養(yǎng)平板進(jìn)行驗證：取細(xì)胞培養(yǎng)上清，無菌環(huán)境下涂布細(xì)菌專用的固體培養(yǎng)基平板，置于生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-72h，觀察是否產(chǎn)生菌落。此方法更準(zhǔn)確，但要求實驗室有微生物培養(yǎng)設(shè)備和材料，同學(xué)們可以根據(jù)自己的實際情況選擇合適的方法。
▲ LB平板菌檢（左：陽性 右：陰性）
總之，面對細(xì)胞中的小黑點，我們無需過分恐慌。只要我們深入了解細(xì)胞碎片與微生物污染的特征，并掌握正確的判斷方法，便能輕松應(yīng)對。
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