超濾法制備外泌體 | Amicon® Ultra超濾管應用方案

時間：2023/11/15閱讀：717

默克Amicon^®Ultra 超濾管采用低蛋白吸附的Ultracel^®再生纖維素超濾膜，確保更精準的截留分子量和更高的蛋白回收率。因其優(yōu)異的性能，Amicon^®Ultra 超濾管已被廣泛應用于多種樣品制備的場景，包括蛋白/抗體/酶/核酸等生物樣本的濃縮、脫鹽和緩沖液置換、病毒/噬菌體/外泌體/囊泡/微粒等樣本的純化、藥物篩選、藥物結(jié)合實驗、蛋白富集、小分子物質(zhì)去除、分析樣品前處理等，為科學研究提供高效的創(chuàng)新方案。

外泌小體（Exosome）是一種囊泡結(jié)構(gòu)，直徑通常在30-150nm，常見于正常體液和病理樣本，培養(yǎng)細胞也可分泌。研究人員已經(jīng)在血液、唾液、尿液、母乳等中發(fā)現(xiàn)外泌小體，其運載的蛋白和核酸涉及其細胞間物資、信息交流，影響和調(diào)控著多方面的生理功能，包括腫瘤發(fā)生、免疫促進、凋亡調(diào)控、血管生成、炎癥反應及發(fā)育和分化等。由于在體液中出現(xiàn)，外泌小體對于臨床生物標志物檢測特別有利，成為體外診斷、biomarker研究的新熱點。

之前我們有文章介紹通過PS（磷酯酰絲氨酸）親和法提取外泌體，今天給大家介紹另外一種提取外泌體的方法——超濾法。說到超濾，那就不得不提默克的超濾管了，默克Amicon^®Ultra 系列超濾管相信大家基本都有所了解，很多老師應該都有用過。

圖片1(1).png

超濾法提取外泌體

兩步法細胞上清的外泌體分離

操作步驟：從細胞培養(yǎng)上清中制備外泌體

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步驟01

樣品澄清

1、將培養(yǎng)基上清從培養(yǎng)瓶中轉(zhuǎn)移到50ml錐形管中；

2、旋緊Steriflip^®組件（貨號:SCGP00525，0.22µm，PES膜）至樣品管頂部，打開樣品管末端；

3、倒置組件并固定在基座或架子上；

4、將調(diào)節(jié)真空源連接到Steriflip^®裝置側(cè)面的真空端口上。打開真空使溶液通過膜進入空管；

5、拆下Steriflip^®裝置并蓋上樣品。將過濾后的樣品保存在4°C或進行囊泡富集。

本離心超濾方案基于使用AU-15超濾管（10kDa MWCO，#UFC901024）處理15mL樣品。如果要使用不同的體積或超濾管規(guī)格（AU-0.5，AU -2或AU-4mL），請參閱相應的Amicon^®Ultra超濾管使用說明書。

步驟02

超濾管平衡

1、向超濾管中加入2ml PBS，蓋上蓋子，在4,000xg的擺桶轉(zhuǎn)子中離心10分鐘；

• 對于AU-2和AU-4，可以使用相同的離心機轉(zhuǎn)速。如果要使用固定角度轉(zhuǎn)子，請查閱設備用戶指南以獲得適當?shù)霓D(zhuǎn)速和體積限制。
• 對于AU-0.5，樣品在可容納1.5mL管的固定轉(zhuǎn)子中以14,000xg離心。

2、移去超濾裝置底部未過濾的PBS，抽取收集管里的濾液。

• 對于AU-2、AU-4和AU-15，可通過移液器去除濾液。
• 對于AU-0.5，可1000 x g 反轉(zhuǎn)離心2分鐘去除濾液，移除收集管中PBS或更換新的收集管。

步驟03

樣品超濾

1、像AU-15超濾管中加入15ml樣品，蓋上蓋子；

2、 4,000xg離心30分鐘；

備注：終產(chǎn)品體積通常大約500µL（30倍濃度），但根據(jù)樣品的性質(zhì)、流速和離心時間可能會有所不同。有關(guān)樣品體積和終體積的估計，請參閱對應Amicon^®Ultra超濾管使用說明書。

3、從離心機上取下超濾裝置，棄除收集管里的液體；

4、往過濾裝置中加入14mL PBS，移液器輕輕吸吐多次。4,000xg離心30分鐘；
5、從過濾裝置中回收濃縮樣品；
• 對于AU-2、AU-4和AU-15，可用移液器吸取樣品，并多次沖洗膜側(cè)壁（每側(cè)3-4次）以確?；厥?。
• 對于AU-0.5，將過濾器倒扣在干凈的離心管中。在2000xg下離心1分鐘，將樣品轉(zhuǎn)移到試管（反向旋轉(zhuǎn)）。

6、細胞外囊泡樣品準備好進行分析。

注意事項及補充提示：

• 無血清樣品選擇3kDa孔徑是為了盡可能提高外泌體的回收率；
• 有血清樣品選擇100kDa/500kDa孔徑是為了盡可能去除細胞分泌蛋白以及血清成分中小于外泌體的白蛋白造成的影響；
• 研究者可根據(jù)樣品的粘稠程度，以及需要制備的目標外泌體/囊泡/顆粒的大小分布來選擇和優(yōu)化超濾孔徑（3kDa/10kDa/30kDa/50kDa/100kDa），以便達到更好的得率和操作體驗；
• 樣品體積大于30mL時可以考慮用超濾杯或Centricon plus -70超濾管，請注意攪拌式超濾杯在200mL以內(nèi)時吸附損耗可能較離心式超濾管略偏高；
• 如需進一步提高特定外泌體的純度，可選用包被相應抗體的磁珠進行親和純化精制。

超濾法制備的外泌小體參考數(shù)據(jù)

多維度分析4個SH-SY-5Y細胞系的外泌小體樣品（含或不含血清）：