在細胞培養(yǎng)中，血清作為不可-或缺的關鍵試劑，對細胞的生長狀態(tài)具有直接影響。因此，正確選擇和使用血清至關重要。
本期細胞學堂將全面探討血清的各個方面，深入分析選擇血清的考量要點，并探討血清在細胞培養(yǎng)中遇到的常見問題，如血清的儲存和解凍、血清與微生物污染的關系、血清絮狀物析出的原因等，同時提供解決方案，助您的實驗更順暢。
血清的簡介及分類
血清是什么？
血清是指血液凝固后，從血漿中除去纖維蛋白原及某些凝血因子后分離出的淡黃色透明液體，或指已經(jīng)去除纖維蛋白原的血漿（見圖1）。在細胞培養(yǎng)中，動物血清因其富含多種營養(yǎng)成分，對細胞生長至關重要，因此被廣泛應用。
圖1. 全血、血漿和血清示意圖
血清的分類有哪些？
動物血清根據(jù)動物種屬的不同，可分為牛血清、馬血清、雞血清、兔血清、豬血清等。其中，牛源血清尤為常見，且根據(jù)采血牛的年齡不同，可分為胎牛血清、新生牛血清、小牛血清和供體血清（見表1）。胎牛血清因其獨-特的優(yōu)勢，如低抗體水平和高生長因子含量等，在細胞培養(yǎng)中表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，但其價格也相對較高。為了滿足多樣化的實驗需求，市面上推出了多種類型的胎牛血清，如天然低IgG胎牛血清、干細胞專用胎牛血清以及透析型胎牛血清等。
表1 牛血清類別與胎齡對應關系如下
No. | 牛血清類別 | 胎齡 |
1 | 胎牛血清（FBS） | 胎兒（母牛懷孕3-8個月） |
2 | 新生牛血清(NBS/NCS) | NBS嚴格：出生24 h內(nèi) NCS寬泛：出生14日內(nèi) |
3 | 小牛血清（CS） | 16-22周 |
4 | 供體血清 | 成年牛 |
血清在細胞培養(yǎng)中至關重要。鑒于不同實驗對血清的需求不同，建議根據(jù)實驗需要選擇適合的血清類型。必要時，也可針對特定細胞進行血清篩選試驗，以篩選出最-適合的血清。然而，近年來無血清培養(yǎng)基正逐漸興起。無血清培養(yǎng)基通過添加生長因子等模擬血清功能，避免了血清的批次差異和潛在污染問題，因此被認為是未來細胞培養(yǎng)的必然趨勢。
血清的作用及選擇
血清在細胞培養(yǎng)中的重要性不容忽視。它不僅是細胞生長的必-備營養(yǎng)成分，還對細胞的狀態(tài)和功能有重要影響。其主要作用包括以下幾點：提供細胞生長所必需的基本營養(yǎng)物質(zhì)，如氨基酸、維生素、無機物、脂類物質(zhì)、核酸衍生物等；提供激素和各種生長因子，支持細胞的生長和增殖；提供結合蛋白，通過結合蛋白攜帶重要的低分子量物質(zhì)，確保它們在細胞內(nèi)外正確傳遞；為細胞提供一定的保護作用，如防止外界環(huán)境的損傷，為細胞營造一個相對穩(wěn)定的生長環(huán)境。
在細胞培養(yǎng)時，選擇適合的血清對細胞生長至關重要。選擇血清時需綜合考慮以下因素：
細胞特性
不同類型的細胞對血清種類需求不同。大多數(shù)細胞培養(yǎng)更適合使用牛血清，特別是胎牛血清（FBS）。但對于某些細胞，如MCF 10A、NK-92、PC-12（未分化）等，通常建議使用含有馬血清的培養(yǎng)基。此外，不同類型細胞對血清的濃度需求也有所不同。通常，血清使用的濃度范圍為10-20%，但對于某些細胞類型，如人支氣管上皮細胞、大鼠胰腺導管上皮細胞等，常使用含2% FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)。
實驗需求
在選擇血清時，需要根據(jù)實驗的具體需求選擇合適的血清，特別是其營養(yǎng)成分和生長因子的種類及含量是否滿足所培養(yǎng)細胞的需求。有些類型細胞，除了添加血清外，還要格外添加生長因子或抑制劑來調(diào)節(jié)細胞的生長行為，如大鼠破骨細胞、小鼠肺微血管內(nèi)皮細胞等。即使是同一細胞，如BEAS-2B細胞，其血清需求也會因?qū)嶒炐枨蟮牟煌兴兓?。因此，是否使用含血清培養(yǎng)基需根據(jù)實驗需求來決定。在含有血清的培養(yǎng)基中，BEAS-2B保留了對血清反應進行鱗關分化的能力，細胞在密度較低時呈長梭型（見圖2），隨著密度的增加，形態(tài)會變短。相反，在不含血清的培養(yǎng)基（BEBM支氣管上皮細胞生長培養(yǎng)基）中，BEAS-2B細胞會呈現(xiàn)典型的呼吸上皮細胞多邊形態(tài)（見圖3）。
圖2. BEAS-2B在DMEM培養(yǎng)基（含10%血清）
圖3. BEAS-2B在BEGM培養(yǎng)基（不含血清）中的培養(yǎng)
熱滅活的主要作用是降低血清中補體成分的活性，甚至使其完-全失活。在某些特定情況下，為避免補體蛋白干擾細胞生長和功能，要使用熱滅活處理后的血清來培養(yǎng)細胞[1-3]。然而，熱滅活過程可能導致血清中產(chǎn)生一些沉淀，消耗其中的營養(yǎng)物質(zhì)，影響細胞生長。因此，通常不建議對血清進行熱滅活。
血清品質(zhì)
不同廠家的血清來源、生產(chǎn)工藝和包裝運輸?shù)榷加胁町悾ㄗh選擇知-名品牌和質(zhì)量穩(wěn)定的血清。由于動物血清的成分復雜，即使是同一廠家，不同批次之間的差異也可能會影響細胞的增殖和形態(tài)。如L-929細胞培養(yǎng)更換不同批次血清后，細胞形態(tài)有明顯差異（見圖4）。因此，建議選定血清品牌后，盡量避免更換，并適當儲備同一批次的血清以減少批次差異對細胞培養(yǎng)影響。如果必須要更換血清，建議采用梯度替換方法，逐步過渡，以減少對細胞的影響。具體操作如下：首先用25%新血清與75%原血清進行混合，培養(yǎng)傳代1-2次；然后用50%新血清與50%原血清混合培養(yǎng)；接著用75%新血清與25%原血清混合培養(yǎng)；最后完-全使用新血清培養(yǎng)。
圖4. L-929細胞剛更換血清（左），一周后（右）
使用血清常見問題分析
血清保存
血清通常需要在-20℃或-80℃條件下進行長期冷凍保存。若保存不當，可能會導致血清質(zhì)量降低，從而對實驗結果產(chǎn)生不良影響。對于每次使用量較少的情況，建議將解凍后的血清分裝并重新凍存，以避免因反復凍融而影響血清的品質(zhì)。解凍后的血清應存放于2-8℃，并盡量在一個月內(nèi)使用完畢。
血清解凍
血清應在2-8℃條件下緩慢解凍，以防止因溫度變化過快導致的品質(zhì)下降。在解凍過程中，應定時輕輕搖勻，以確保溫度均勻分布，防止局部過熱，并盡量避免氣泡形成，從而減少沉淀的產(chǎn)生。
微生物污染
若血清被細菌、真菌或支原體等微生物污染，會影響細胞的生長?？赏ㄟ^檢查外包裝是否完好、將血清接種到培養(yǎng)基種觀察是否有菌落形成，或使用支原體檢測試劑盒等方法確認血清是否被污染。一旦確認血清被污染，由于其品質(zhì)已無法保證，因此不建議進行任何處理后再繼續(xù)使用。因此，在使用血清的過程中，應嚴格遵守無菌操作規(guī)程，防止微生物污染。
析出物
血清在解凍過程中可能產(chǎn)生析出物（見圖5），這些析出物可能呈現(xiàn)為小黑點或纖維樣沉淀。鏡下觀察有時會看到小黑點呈布朗運動。關于這些析出物的成因，存在多種說法：有人說是“黑膠蟲污染"，有人認為是血清原蟲或被誤判為菌類污染。然而，更為普遍的觀點認為，小黑點或纖維樣沉淀析出物其實是血清中某些成分，如纖維蛋白、磷酸鈣、膽固醇等析出。少量析出物一般不會影響血清的品質(zhì)，可在37℃溫度下輕微溶解（不建議加熱）。如血清中析出物較多，可通過離心（400 ×g，3 min）去除。
圖5. 血清融解時混勻 （左），血清靜置融解不混勻血清沉淀（中），血清靜置融解不混勻出現(xiàn)小黑點（右）
血清在細胞培養(yǎng)中扮演著不可-或缺的角色，對細胞生長狀態(tài)具有直接的影響。因此，在選擇血清時，我們需要綜合考慮細胞特性、實驗的具體需求以及血清品質(zhì)等多種因素，以確保選擇到適合的血清。同時，在使用血清的過程中，還需妥善保存和解凍，并嚴格遵守無菌操作規(guī)程，以防止血清被污染。
以上是關于血清的分類、選擇和使用常見問題的介紹，更多細胞培養(yǎng)干貨，請持續(xù)關注細胞學堂專欄~
參考文獻
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