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            深圳市安培生物科技有限公司
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            酵母雜交實驗——從一無所知到略知一二

            時間:2021/9/3閱讀:2268
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            低分文章要想逆襲,實現(xiàn)向高分文章的跳躍,就一定少不了要將細胞豪門中分子間錯綜復(fù)雜的關(guān)系屢屢清楚。為了找尋能讓自家目的蛋白榮登科研“頭條榜"的“花邊新聞",一眾科研者可謂是操碎了心。慶幸的是,酵母雙雜交(Yeast Two-Hybrid,Y2H)和酵母單雜交(Yeast One-Hybrid,Y1H)實驗讓蛋白質(zhì)與其好友(蛋白質(zhì)、DNA、RNA)的關(guān)系在科研者面前變得無所遁形。


            蛋白釣魚術(shù)——酵母雙雜交(Yeast Two-Hybrid,Y2H)

            通常一個蛋白在本性上可以同時喜歡很多其他的蛋白,但最終還是會有個最喜歡的,而在 Y2H 中就能發(fā)現(xiàn)他的喜好。換言之,Y2H 就是研究一群男女間的自由戀愛問題,而它為兩個蛋白牽線拉橋的方法,簡單概括起來就一句話:廣撒網(wǎng),釣大魚。

            首先,把目的基因構(gòu)建成 DNA 結(jié)合質(zhì)粒(BD 質(zhì)粒)轉(zhuǎn)入 a 型酵母中形成釣餌(Bait);其次將全 cDNA 片段構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄激活質(zhì)粒(AD 質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化到 b 型酵母中,每個 b 型酵母含有一個隨機的 AD 質(zhì)粒,就形成了酵母庫;最后利用酵母接合生殖的特征使得 AD 和 BD 兩個質(zhì)粒 同時進入到一個酵母中,當目的蛋白和酵母庫中 AD 質(zhì)粒所表達的蛋白相“合拍"時,質(zhì)粒上的氨基酸合成基因就會被啟動激活,使得酵母可以在營養(yǎng)缺陷型的培養(yǎng)基上生長了,這樣就 弄清楚誰才是目的蛋白的“命中真愛"了。 

            然而在 Y2H 中,由于酵母庫的構(gòu)建是通過 cDNA 片段鏈接到質(zhì)粒上的,經(jīng)常會產(chǎn)生 2/3 移碼突變的假陽性。因而,在研究蛋白質(zhì)互作過程中,在用 Y2H 來篩選出相關(guān)蛋白后,還需用 Co-IP 和 GST pulldown 進行驗證,看看目的蛋白對“真愛"是否做到了“沒有你不行"又或者可能“腳踏兩只船"還擁有其他的新伙伴??傊挥幸揽靠b密的陰性、陽性對照才能真正在蛋白實驗中披沙揀金、去偽存真。



            DNA 識別者——酵母單雜交(Yeast One-Hybrid,Y1H)

            而一提及蛋白質(zhì)與 DNA 之間千絲萬縷的關(guān)系,各位小伙伴立刻會向 ChIP-qPCR,ChIP-RNAseq 或熒光素酶報告實驗等“神助攻"來尋求幫助。 

            可是你造么?通過酵母單雜交(Y1H),可快速鑒定與感興趣的特定調(diào)節(jié) DNA 序列(bait 序列)相互作用的蛋白質(zhì),除了“明星蛋白"異源轉(zhuǎn)錄因子,還可找到一些其他“幕后英雄",如 DNA 復(fù)制蛋白、修復(fù)蛋白及抑制蛋白。更重要的是,Y1H 還有著一項得天獨厚的優(yōu)勢:可檢測蛋白異構(gòu)體(isoform)與 DNA 特異性相互作用,而這正是依賴于敏感和特異性抗體綁定到特定靶蛋白的 ChIP 很難做到的。

            舉個栗子,當通過各類芯片篩選出了一個在腫瘤組織中異常高表達的差異基因 A,可通過 Y1H 實驗為其組織一場相親大會:即將構(gòu)建含有報告基因(基因 A 作為 Bait 序列)的酵母單細胞株,與后續(xù)導(dǎo)入該菌株的表達特定蛋白的表達質(zhì)粒庫“見面",如果某蛋白能與上游的 Bait 序列“情孚意合",可使融合激活結(jié)構(gòu)域(AD)與報告基因的啟動子元件緊密接近,從而激活報告基因的下游轉(zhuǎn)錄,使得酵母可以在營養(yǎng)缺陷型的培養(yǎng)基上生長。接下來就可對該蛋白調(diào)控基因 A 的機制進行深入研究。 

            然而,任何篩選都存在假陽性,Y1H 也不例外;且 Y1H 不提供關(guān)于 DNA-蛋白質(zhì)相互作用的功能性后果的任何信息。可見在生物實驗中,單一的證據(jù)都是薄弱的,無論它貌似多么正確,也要通過對照和多方取證才能確定真正的事實。 



            升級版——酵母三交技術(shù)(Yeast Three-hybrid,Y3H)

            目前,從基本科學(xué)和臨床角度上,通過 Y3H 來理解與 RNA 病毒相關(guān)的疾病過程是很重要的。而在具體的實踐過程中,Y3H 可以用于篩選 RNA 文庫以及 cDNA 文庫。由于 Y3H 在現(xiàn)階段還是一種新技術(shù),所以迄今為止對其的相關(guān)報道還是比較少的。


            參考文獻: 

            1)An Overview of Yeast Two-Hybrid (Y2H) Screening 

            2)An overview of the Yeast one-hybrid assay 

            3)Two Hybrid Services

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