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大腸桿菌
LB 葡萄糖緩沖液 乙酸鉀
離心管
1. 單個大腸桿菌克隆接種到 2 ml 含適當抗生素的 LB 中。37℃ 劇烈振蕩孵育 5~8 小時。或者可以培養(yǎng)過夜使飽和。
2. 倒 1.5 ml 培養(yǎng)液到已作標記的微量離心管中。把剩下的培養(yǎng)液存放在 4℃。
3. 在微量離心機上離心 2 分鐘以沉淀大腸桿菌。吸掉培養(yǎng)液。
4. 用 100 ul 葡萄糖緩沖液重懸沉淀物。在室溫孵育 5 分鐘。在這時候充分懸浮大腸桿菌對于獲得盡可能大的產量是很重要的。
葡萄糖緩沖液（配 500 ml）
50 mmol/L 葡萄糖 4.5 g 葡萄糖
10 mmol/L EDTA，pH 8.0 10 ml 0.5 mol/L EDTA，pH 8.0
25 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0 12.5 ml 1.0 mol/L Tris-HCl，pH 8.0
過濾除菌，貯存在 4℃。
5. 在管中加 200 ul NaOH-SDS 溶液，輕輕地顛倒混合。冰浴 5 分鐘。溶液應該明顯變清了，但仍然非常黏。
NaOH-SDS 溶液（配 50 ml）
0.2 mol/L NaOH 0.4 g NaOH
1% SDS 2.5 ml 20% (w/v) SDS
可在室溫存放 2~3 周。
6. 每個管中加 150 ul 冷的 3 mol/L 乙酸鉀，pH 5.2，顛倒混合；冰浴 5 分鐘，會形成白色絮狀沉淀。
3 mol/L 乙酸鉀：
5 moI/L 乙酸鉀 60 ml
冰乙酸 11.5 ml
加水到 100 ml。貯存在 4℃。
7. 在小離心機上離心 5 分鐘，然后轉移 400 ul 上清到一個已作標記的管中。
8. 管中加 0.5 ml 酸/氯仿/異戊醇（50:49:1) 溶液，振搖，在離心機上離心 5 分鐘。
酚/氯仿/異戊醇（50:49:1)
50% TE 飽和酚
49% 氯仿
1% 異戊醇
避光貯存于 4℃。
9. 小心地把水相（上層）轉移到已作標記的管中。
10. 加 1.0 ml 100% 乙醇，混合，然后離心 5 分鐘沉淀 DNA。
11. 去掉上清。應該能看到一個小的白色沉淀物。加 1.0 mI 70% 乙醇洗滌沉淀物，并離心 5 分鐘。
12. 去掉上清。管子離心 5 秒鐘使殘余液體流到管底。吸掉液體，讓乙醇揮發(fā) 5~10 分鐘。（或者可以真空干燥管子。）
13. 用 25~50 ul 的 TE（pH 8.0）重懸沉淀物。質粒 DNA 應該很容易溶解。不易溶解的物質很可能不是 DNA。
14. 在這 32 uI DNA 溶液中加 8.0 ul 4 mol/L NaCl 和 40 ul 113% (w/v) PEG8000?；旌暇鶆虿⒈?1 小時或更長時間。
15. 用小離心機在 4℃ 離心 15 分鐘以沉淀 DNA。
16. 小心去掉上清并加 1.0 ml 70% 乙醇洗滌沉淀物，離心 5 分鐘。
17. 小心去掉乙醇，離心 5 秒鐘使殘余液體流到管底。吸掉液體并讓乙醇揮發(fā) 5~10 分鐘。
18. 根據(jù)測序方法的要求用 20~30 ul TE 或水重懸沉淀物。
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