一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備
 

1.  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
 

每次實(shí)驗(yàn)采用10只2-3周齡SD大鼠，雌雄均可，體重40~60 g。

2.  試劑
 

纖連蛋白(fibronectin)、Ⅳ型膠原、鼠尾膠、葡聚糖(dextran，分子量100~200 kDa)和DNA酶I(DNase I)購(gòu)自Sigma公司；D-Hanks'液、10xPBS按配方自制；II型膠原酶購(gòu)自Worthington公司；明膠、牛血清白蛋白(BSA)、HEPES購(gòu)自Amresco公司；Percoll 購(gòu)自Amersham Biosciences；DMEM(高糖)購(gòu)自GIBCO/BRL公司；肝素鈉、NaHCO3購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司；青、鏈霉素購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)自PAA Laboratories；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)，膠原酶/分散酶(collagenase/dispase)購(gòu)自Roche公司。
 

3.   儀器
 

低溫離心機(jī)(Centrifuge 5810 R，購(gòu)自Eppendorf；Himac CR 22F，購(gòu)自Hitachi)。
 

4.  試劑配制
 

（1）1 mg/ml鼠尾膠(用0.2%乙酸配制)，1%明膠(用D-Hanks'液配制)，1%II型膠原酶(用DMEM配制，用時(shí)稀釋成0.1%的濃度)，1%膠原酶/分散酶(用DMEM配制，用時(shí)稀釋成0.1%)，15%葡聚糖(用PBS配制)，20% BSA(用DMEM配制，調(diào)pH值至7.4后用0.45 um濾膜過濾除菌，較難過濾)，DNase I(用冷PBS配制成2 U/ul)，以上試劑經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌后分裝保存于-20℃。

（2）50%Percoll(配12 ml，需6 ml Percoll原液，0.67 ml 10xPBS，0.4 ml FBS，4.93 ml PBS)；DMEM培養(yǎng)液(含4000 mg/L D-葡萄糖，4 mmol/L L-谷氨酰胺，添加3.7 g/L NaHCO3，20 mmol/L HEPES，肝素鈉 100 mg/L，青霉素 100 U/ml，鏈霉素 100 ug/ml)，pH值調(diào)至7.4，過濾除菌后分裝保存于4 ℃，用時(shí)加入20% FBS及1 ng/ml bFGF。
 

二、培養(yǎng)皿預(yù)處理
 

1.  涂布3種不同的基質(zhì)，培養(yǎng)前一天加入1 ml 1%明膠于35 mm塑料培養(yǎng)皿，置于37 ℃培養(yǎng)箱過夜，接種前用D-Hanks'液漂洗2次。

2.  接種前4 h，加入鼠尾膠6~10 ug/cm2，在密閉的器皿里用氨氣熏5~10 min后，置于室溫1~2 h晾干后，用D-Hanks'液漂洗2次。

3.  50 ul 0.1%纖連蛋白、50 ul 1 mg/ml Ⅳ 型膠原和400 ul雙蒸水混合后，加入到每個(gè)培養(yǎng)皿中涂布均勻后吸出，可涂布10個(gè)培養(yǎng)皿，置于37 ℃培養(yǎng)箱1~2 h晾干后，用D-Hanks'液漂洗2次。
 

三、 腦微血管段的分離與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)
 

1.  大鼠頸椎脫臼處死后浸泡于75%乙醇中消毒3~5 min后斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中，打開顱腔后取出全腦置于盛有冷D-Hanks'液的玻璃培養(yǎng)皿中解剖去除小腦、間腦(包括海馬)。

2.  隨后將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動(dòng)以吸除軟腦膜及腦膜大血管后置于新的含冷D-Hanks'液玻璃培養(yǎng)皿中，用細(xì)解剖鑷去除大腦白質(zhì)、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質(zhì)。

3.  用D-Hanks'液漂洗3次后，加入1 ml DMEM培養(yǎng)液，用虹膜剪將其剪碎成1 mm3大小，加入0.1%Ⅱ型膠原酶(含30 U/ml DNase I，1 ml/大腦)混勻后37 ℃水浴消化1.5 h。

4.  離心(1 000 rpm，8 min，室溫)，去上清液，加入20% BSA懸浮混勻后離心(1000 g，20 min，4 ℃)或加入15%葡聚糖懸浮混勻后離心(4 000 rpm，20 min，4 ℃)，去除中上層神經(jīng)組織及大血管，保留底部沉淀。

5.  加入2 ml 0.1%膠原酶/分散酶(含20 U/ml DNase I)懸浮混勻后37 ℃水浴消化1 h，離心(1 000 rpm，8 min，室溫)，去上清液，加入2 ml DMEM培養(yǎng)液懸浮后鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12 ml 50% Percoll(25 000 g，60 min，4 ℃)。

6.  離心(1 000 g，10 min，4 ℃)，靠近底部的紅細(xì)胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段，吸出后用DMEM漂洗兩次(離心1 000 rpm，5 min，室溫)，去上清液。

7.  加入DMEM*培養(yǎng)液(含20% FBS，100 μg/ml肝素鈉)懸浮后接種于涂布基質(zhì)的35 mm一次性塑料培養(yǎng)皿(1.5 ml/培養(yǎng)皿，可接種1個(gè)培養(yǎng)皿/大腦)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，12~24 h后換液，并加入1 ng/ml bFGF，隨后隔天換液。

 

四、鑒定方法
 

形態(tài)學(xué)、Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組織化學(xué)檢測(cè)。
 

五、 結(jié)果
 

1.   細(xì)胞形態(tài)觀察
 

接種當(dāng)時(shí)可見由圓形的內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的呈單枝狀或分枝狀的腦微血管段，并可見散在的單細(xì)胞及組織碎片(見圖1-1)；培養(yǎng)12~24 h后可見培養(yǎng)的細(xì)胞從貼壁的微血管段周圍長(zhǎng)出，細(xì)胞呈短梭形，區(qū)域性單層生長(zhǎng)，經(jīng)換液后微血管段的殘余部分不斷減少，成纖維細(xì)胞、周細(xì)胞等雜細(xì)胞含量較少；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，內(nèi)皮細(xì)胞不斷增殖，可見"漩渦"分布，大約5~7天細(xì)胞達(dá)到融合，短梭形的內(nèi)皮細(xì)胞占90%以上，但可見少量周細(xì)胞等雜細(xì)胞生長(zhǎng)于內(nèi)皮細(xì)胞單層表面或細(xì)胞克隆間隙(結(jié)果未顯示)。細(xì)胞生長(zhǎng)過程見圖1，細(xì)胞接種于纖連蛋白/Ⅳ型膠原涂布的培養(yǎng)皿。


 

2.   涂布不同基質(zhì)的細(xì)胞生長(zhǎng)情況
 

明膠及鼠尾膠涂布的培養(yǎng)皿微血管段貼壁時(shí)間較長(zhǎng)，6 h時(shí)可見少量微血管段貼壁但無內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)出，12~24 h可見一些內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)出，24 h后腦微血管段*貼壁并有較多的內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)出，兩者無明顯差異(見圖2-1~4)；纖連蛋白/Ⅳ型膠原涂布的培養(yǎng)皿培養(yǎng)后6 h即可見微血管段貼壁并有一些內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)出，12~24 h內(nèi)基本*貼壁并有較多的內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)出(見圖2-5,6)。


 

3.  免疫組化鑒定
 

Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化檢測(cè)可見培養(yǎng)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿及核周有棕黃色著色，胞核呈空泡狀結(jié)構(gòu)；對(duì)照染色為陰性。