細(xì)胞培養(yǎng)遇到問(wèn)題？怎么解決？

時(shí)間：2022/1/15閱讀：2026

培養(yǎng)細(xì)胞的過(guò)程中，時(shí)常會(huì)遇到各種的問(wèn)題，怎么辦？以下是整理的一些常用問(wèn)題的解決辦法。

培養(yǎng)液pH值變化太快

可能原因：

(1)CO2張力不對(duì)。
(2)培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊。
(3)NaHCO3緩沖系統(tǒng)緩沖力不足。
(4)培養(yǎng)液中鹽濃度不正確。
(5)細(xì)菌、酵母或真菌污染。

建議解決方法：

(1)按培養(yǎng)液中NaHCO3濃度增加或減少培養(yǎng)箱內(nèi)CO2濃度，2.0g/L到3.7g/L濃度NaHCO3對(duì)應(yīng)CO2濃度為5%到10%。
(2)松開瓶蓋1/4圈。
(3)改用不依賴CO2培養(yǎng)液。加HEPES緩沖液至10到25mM終濃度。
(4)在CO2培養(yǎng)環(huán)境中改用基于Earle′s鹽配制的培養(yǎng)液，在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用Hanks鹽配制的培養(yǎng)液。
(5)丟棄培養(yǎng)物，或用抗生素除菌。

培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，但pH值不變

可能原因：

(1)洗滌劑清洗后殘留有磷酸鹽，將培養(yǎng)基成分沉淀下來(lái)。
(2)冰凍保存培養(yǎng)液。

建議解決方法：

(1)用去離子水反復(fù)沖洗玻璃器皿，然后滅菌。
(2)將培養(yǎng)液加熱到37℃，搖動(dòng)使其溶解如沉淀仍然存在，丟棄培養(yǎng)液。

培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，同時(shí)pH發(fā)生變化

可能原因：

(1)細(xì)菌或真菌污染。

建議解決方法：

(1)丟棄培養(yǎng)物，或用抗生素除菌。

培養(yǎng)細(xì)胞不貼壁

可能原因：

(1)胰蛋白酶消化過(guò)度。
(2)支原體污染。
(3)培養(yǎng)瓶瓶底不干凈。

(4)培養(yǎng)液pH值過(guò)堿(NaHCO3分解)。

(5)消化液或培養(yǎng)液配制錯(cuò)誤、過(guò)期儲(chǔ)存、儲(chǔ)存不當(dāng)。
(6)細(xì)胞老化(如傳代前細(xì)胞已匯合導(dǎo)致失去貼附性)。
(7)接種細(xì)胞起始濃度太低或太高。

建議解決方法：

(1)縮短胰蛋白酶消化時(shí)間或降低胰蛋白酶濃度。
(2)分離培養(yǎng)物，檢測(cè)支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。
(3)注意刷洗，或換用一次性塑料培養(yǎng)瓶。
(4)使用無(wú)菌醋酸溶液調(diào)整pH值或充入無(wú)菌CO2(將培養(yǎng)液敞口放入培養(yǎng)箱也可)。
(5)重新配置消化液或培養(yǎng)液。
(6)啟用新的保種細(xì)胞。
(7)調(diào)節(jié)最佳接種細(xì)胞濃度。

懸浮細(xì)胞成簇

可能原因：

(1)培養(yǎng)液中含鈣、鎂離子。
(2)支原體污染。
(3)蛋白酶過(guò)度消化使得細(xì)胞裂解釋。
(4)DNA污染。

建議解決方法：

(1)用無(wú)鈣鎂平衡鹽氵容液洗滌細(xì)胞，輕輕吹吸細(xì)胞獲得單細(xì)胞懸液。
(2)分離培養(yǎng)物，檢測(cè)支原體。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。
(3)用DNase I處理細(xì)胞。

原代細(xì)胞培養(yǎng)物污染

可能原因：

(1)原代培養(yǎng)組織在進(jìn)入培養(yǎng)前已污染。

建議解決方案：

(1)培養(yǎng)前用含高濃度抗生素的平衡鹽溶液反復(fù)沖洗組織。

培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)減慢

可能原因：

(1)由于更換不同培養(yǎng)液或血清。

(2)培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長(zhǎng)必需成分如谷氨酰胺或生長(zhǎng)因子耗盡或缺乏或已被破壞。
(3)培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染。
(4)試劑保存不當(dāng)。
(5)接種細(xì)胞起始濃度太低。
(6)細(xì)胞已老化。
(7)支原體污染。

建議解決方案：

(1)比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)。讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液。
(2)換入新鮮配制培養(yǎng)液，或補(bǔ)加谷氨酰胺及生長(zhǎng)因子。
(3)用無(wú)抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄培養(yǎng)物?；蛴每股爻?br style="margin: 0px; padding: 0px; outline: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box; overflow-wrap: break-word !important;"/>(4)血清需保存在-5℃到-20℃。培養(yǎng)液需在2-8℃避光保存。含血清*培養(yǎng)液在2-8℃保存，并在2周內(nèi)用完。
(5)增加接種細(xì)胞起始濃度，換用新的保種細(xì)胞。
(7)分離培養(yǎng)物，檢測(cè)支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。

培養(yǎng)細(xì)胞死亡

可能原因：

(1)培養(yǎng)箱內(nèi)無(wú)CO2。
(2)培養(yǎng)箱內(nèi)溫度波動(dòng)太大。
(3)細(xì)胞凍存或復(fù)蘇過(guò)程中損傷。
(4)培養(yǎng)液滲透壓不正確。
(5)培養(yǎng)液種有毒代謝產(chǎn)物堆積。
(6)更多原因參考問(wèn)題4和問(wèn)題7。

建議解決方案：

(1)檢測(cè)培養(yǎng)箱內(nèi)CO2。
(2)檢查培養(yǎng)箱內(nèi)溫度。
(3)取新的保存細(xì)胞種。
(4)檢測(cè)培養(yǎng)液滲透壓。注意：大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞能耐受滲透壓為260– 350 mOsm/kg。加入額外試劑如HEPES或藥物都有可能影響培養(yǎng)液滲透壓。
(5)換入新鮮培養(yǎng)液。

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