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            深圳市安培生物科技有限公司
            中級(jí)會(huì)員 | 第5年

            19126518388

            血清系列
            細(xì)胞轉(zhuǎn)染
            支原體清除
            細(xì)胞凍存
            實(shí)驗(yàn)耗材
            分子試劑
            細(xì)胞增殖與凋亡
            Biozellen系列
            培養(yǎng)基
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            TOYOBO(東洋紡)
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            微生物檢測(cè)
            細(xì)胞生物學(xué)
            Corning康寧
            解離試劑
            細(xì)胞類-實(shí)驗(yàn)耗材
            原代細(xì)胞
            植物檢測(cè)系列試劑盒
            SERANA
            BSA
            細(xì)胞系
            生化試劑盒
            環(huán)境檢測(cè)系列試劑盒(AKEN)
            類器官培養(yǎng)
            緩沖器和解決方案
            生物三凝膠基質(zhì)
            細(xì)胞因子分子
            生物樣本庫(kù)
            蛋白研究系列
            修飾檢測(cè)試劑盒

            備擇方案 2 示蹤標(biāo)記細(xì)胞

            時(shí)間:2022/3/10閱讀:1215
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            原理

            材料與儀器

            細(xì)胞懸液/貼壁細(xì)胞 [35S]標(biāo)記L-甲硫氨酸(>800 Ci/mmol)/[35S]標(biāo)記蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物
            PBS(冷凍) 37℃ 示蹤培養(yǎng)基
            配有液體同位素垃圾閥門的真空吸氣器

            步驟

            1. 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)和每個(gè)樣品準(zhǔn)備 0.5 × 107 ~2 × 107 細(xì)胞, 每 0 .5 × 107 ~2 × 107 細(xì)胞用 2 ml 0.1~0.2 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸脈沖標(biāo)記 10~30 min (見基本方案步驟 1~4,或見備擇方案 1 步驟 1~5)。


            2. 去除 [35S] 甲硫氨酸的工作溶液,用 10 ml 37℃ 的示蹤培養(yǎng)基洗一次,并加入 10 ml 37℃ 的示蹤培養(yǎng)基。


            3. 37℃ 培養(yǎng)到預(yù)期時(shí)間。擰緊試管蓋子在旋轉(zhuǎn)情況下培養(yǎng)細(xì)胞懸液。在 032 培養(yǎng)箱里孵育貼壁細(xì)胞。


            4. 刮取貼壁細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到 15 ml 離心管。收集刮取的細(xì)胞或細(xì)胞懸浮液于 4℃ 300 g 離心 5 min。


            5. 可選:通過(guò) TCA 沉淀法測(cè)定標(biāo)記摻入的量(見輔助方案)。

            注意事項(xiàng)

            1. 將2倍體積含有過(guò)量未標(biāo)記甲硫氨酸(15mg/L)的示蹤培養(yǎng)基直接加入到標(biāo)記混合物中,能夠快速終止標(biāo)記反應(yīng)。

            2. 示蹤≤2 h,細(xì)胞懸液的最終濃度應(yīng)該是 2 × 106 細(xì)胞/ml,或示蹤>2 h,用 0.5 × 106 細(xì)胞/ml。 對(duì)貼壁細(xì)胞而言,加 10 ml/100 mm 平皿。

            常見問題

            1. 上清可以棄掉,也可以收集起來(lái)用于分析分泌或脫落到培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)。

            2. 如果細(xì)胞沉淀不馬上使用的話,見基本方案步驟7。

            同實(shí)驗(yàn)其他方法

            氨基酸代謝標(biāo)記實(shí)驗(yàn)

            1. 室溫融化 [35S] 標(biāo)記甲硫氨酸,并用預(yù)熱的(37℃)脈沖標(biāo)記培養(yǎng)基制備 0.1~0.2 mCi/ml 的工作溶液。2. 室溫下 300 g 離心 5 min,獲得懸液中 0.5 × 107~

            備擇方案 1 對(duì)貼壁細(xì)胞

            1. 在 100 mm 組織培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細(xì)胞到 80%~90% 融合(0.5 × 107~2 × 107 細(xì)胞,取決于細(xì)胞類型)。2. 如上所述制備 [35S] 甲硫氨酸的工作液體(見基本方案步驟 1

            備擇方案 3 長(zhǎng)期細(xì)胞標(biāo)記

            1. 在預(yù)熱的 37℃ 長(zhǎng)期標(biāo)記培養(yǎng)基中制備 0.02~0.1 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸工作溶液(見基本方案步驟 1)。2.1 對(duì)于懸浮細(xì)胞:用預(yù)熱的長(zhǎng)期標(biāo)記培養(yǎng)基準(zhǔn)備并洗細(xì)胞一次

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