1. 將組織移人新鮮、無菌的 DBSS 中，淸洗。

2. 轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)皿（9 cm 皮氏平皿，非組織培養(yǎng)級別），切除多余組織，如脂肪或壞死組織。

3. 將組織轉(zhuǎn)移至第三個平皿中，用交叉的手術(shù)刀細切成大約 1 mm3 大小。

4. 用 10~20 ml 廣口移液管將組織移入 15 ml 或 25 ml 無菌離心管或常用的容器，中（先用 DBSS 濕潤移液管，否則組織塊易貼壁）。

5. 讓組織塊沉降。

6. 用 DBSS 重懸清洗組織，組織塊沉降后，去除上清液，重復(fù)此步驟兩次以上。

7. 將 20~30 個組織塊接種于一個 25 cm2 的培養(yǎng)瓶中，另一瓶中接種 100~200 塊。

8. 吸凈 DBSS，每瓶中加入 4.5 ml 含血清的培養(yǎng)基（如 DMEM/F12加10 % 胎牛血清）。

9. 加入 0.5 ml 粗制膠原酶（2000 U/ml，Worthington CLS 或 Sigma 1A），終濃度為 200 U/ml。

10. 于 37°C 培養(yǎng) 4~48 h，無需振蕩。腫瘤組織（如乳腺或結(jié)腸的硬癌）由于分解較慢，可作用 5 天或更長時間。有時由于時間過長 pH 過度下降（pH<6. 5），要將組織離心并用新的培養(yǎng)基和膠原酶重懸。

11. 輕輕晃動培養(yǎng)瓶檢查分離情況：組織塊呈點狀分布于培養(yǎng)瓶底部，適當(dāng)吸打后分散成單一細胞或小的組織塊。

12. 有些組織（肺、腎、結(jié)腸或乳腺癌）的部分上皮細胞小團塊對膠原酶耐受，沉淀 2 min 即可與其他剩余組織分離。若將其用 DBSS 重懸，沉淀后將沉淀物接種于培養(yǎng)基中，將形成生長旺盛的上皮細胞島。上皮細胞往往在未完-全解離時存活較好。

13. 完-全分解或組織塊沉降后，收集上清液中的細胞，于 50~100g 離心 3 min（離心管或常規(guī)容器，15~50 ml，依據(jù)處理組織的量而選擇）。

14. 去除 DBSS 或培養(yǎng)基上清液，重懸，加入 5 ml 培養(yǎng)基，接種于 25 cm2 培養(yǎng)瓶中。若膠原酶作用時 pH 下降了（pH< 6.5 達 48 h )，去除膠原酶后用 2 倍或 3 倍培養(yǎng)基稀釋細胞懸液。

15. 于 48 h 后更換培養(yǎng)基。

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