1. 將組織（1~5 g，預(yù)先稱重）移入加有新配制的無菌 DBSS 的皮氏培養(yǎng)皿中，清洗。

2. 轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)皿中，切除多余組織如脂肪和壞死組織。

3. 轉(zhuǎn)入第三個培養(yǎng)皿中，用交叉的手術(shù)刀細(xì)切成大約 3 mm3 的小塊。胚胎的器官若小于 3 mm3 ，可全部保留。

4. 用彎鑷子將組織塊移入一個預(yù)稱重的 15 ml 或 50 ml 無菌離心管內(nèi)。

5. 讓組織塊沉降。

6. 用 DBSS 重懸清洗組織塊，沉降后去除上清，重復(fù)此步驟兩次以上。

7. 小心去除剩余液體，預(yù)先稱重。

8. 每克組織加入 10 ml 溶于 RPMI1640 或 S-MEM 的 0.25 % 胰蛋白酶（0.25 粗制胰蛋白酶溶于無血清的 RPMI1640或 MEM/Stirrer salt (S~MEM ) 中），置于 4°C 。

9. 4°C 放置 6~18 h 。

10. 小心吸去胰蛋白酶，余下組織及殘余胰蛋白酶（若需要，此時可加人 1~2 ml 其他酶，如膠原酶、透明質(zhì)酸酶、脫氧核糖核酸酶等）。

11. 37°C 放置 20~30 min 。

12. 加入溫培養(yǎng)基，大約每 100 mg 初始的組織加 1 ml，輕輕上下吸打混合物至組織完-全分散開。

13. 若部分組織未分散，細(xì)胞懸液可用無菌的平紋紗布或不銹鋼篩（100~200 μm )，或一次性使用的塑料篩濾網(wǎng)過濾細(xì)胞，或者讓大的組織塊沉降。當(dāng)有較多組織時，可于每克組織中多加入 20 ml 培養(yǎng)基促進(jìn)沉淀和隨后的懸液收集，通常 2~3 min 就足以去除大多數(shù)的大塊組織。

14. 用血球計數(shù)板或電子計數(shù)儀測定懸液的細(xì)胞密度，檢査活細(xì)胞比率。

15. 細(xì)胞群體為異源性，由于校準(zhǔn)口徑較困難，因而初次使用電子計數(shù)儀時，需要用血球計數(shù)板來確認(rèn)。

16. 將細(xì)胞懸液生長培養(yǎng)基（生長培養(yǎng)基（如DMEM/F12，含10% 胎牛血清））稀釋，使每毫升培養(yǎng)基含有 1×106 個細(xì)胞。按照需求接種于多個培養(yǎng)瓶（25 cm2、75cm2 培養(yǎng)瓶）中，大約每平方厘米為 2×105 個細(xì)胞。當(dāng)存活率不明確或難以預(yù)知時，細(xì)胞計數(shù)便無價值（如腫瘤活檢時，死亡細(xì)胞的比例很高）。在這種情況下，建議按每毫升 5~25 mg 組織的濃度接種。

17. 間隔一定時間更換一次培養(yǎng)基（2~4 天，以 pH 下降為標(biāo)準(zhǔn)）。由于部分細(xì)胞黏附較慢甚至易于懸浮生長，所以丟棄上清前要先檢査上清液中是否有存活的細(xì)胞。

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冷胰蛋白酶解離組織

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