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            深圳市安培生物科技有限公司
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            CHO-K1倉鼠卵巢細胞株的培養(yǎng)方法

            時間:2024/4/10閱讀:1061
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            中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)細胞是第一個被美國FDA、歐盟EMA和中國CFDA認可的用于生物制藥領域的生產(chǎn)細胞,已廣泛應用于各種治療性蛋白質(zhì)藥物的大規(guī)模制備,包括重組抗體、重組單體蛋白質(zhì)以及重組融合蛋白質(zhì)等。CHO-K1是未經(jīng)改造的野生型CHO細胞。最原始的CHO-K1細胞是貼壁培養(yǎng),并需要添加血清,由于血清的批間穩(wěn)定性問題,及后來病毒安全性問題,無血清懸浮培養(yǎng)成為趨勢。實驗室常以貼壁的CHO K1細胞構建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。

             

                                            圖片


            細胞形態(tài):長梭形(10×倍鏡)
            培養(yǎng)條件:DMEM/F12培養(yǎng)基,胎牛血清終濃度為10%
            培養(yǎng)溫度:37°C

            細胞復蘇:


            1.在攝氏37度的水浴中輕輕攪動,為防止受到污染,不要把O形環(huán)和蓋子放在外面。解凍應迅速(約2分鐘)。
            2.解凍后把凍存管盡快從水中拿出來,用75% 乙醇浸泡或噴灑消毒乙醇。從現(xiàn)在開始所有的操作都應該進行在嚴格的無菌條件下進行。
            3.將細胞懸液轉(zhuǎn)移到含有9 ml(血清)細胞培養(yǎng)基的離心管中,10000 rpm離心5分鐘。
            4.棄上清,用(血清)細胞培養(yǎng)基重懸細胞,轉(zhuǎn)移至T25細胞培養(yǎng)瓶中。
            注意:在T25瓶加入細胞之前,可以先將包含(血清)細胞培養(yǎng)基的容器放入培養(yǎng)箱內(nèi)至少15分鐘,以便培養(yǎng)基達到正常PH(7.0至7.6)。
            5.將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。


            細胞傳代:


            1.棄去培養(yǎng)基,用PBS沖洗兩遍細胞層,以消除所有痕量的血清
            2.加入2.0 ~ 3.0 mL  0.25%(w/v)胰蛋白酶溶液消化細胞,在倒置顯微鏡下觀察細胞直到細胞層分散。
            注意:為了避免結塊,請不要通過擊打或搖晃瓶子??稍?7℃培養(yǎng)箱等待細胞,加快細胞分散的速度。
            3.加入6 - 8 mL的(血清)細胞培養(yǎng)基終止消化并反復吹打,轉(zhuǎn)移至離心管,1000 rpm 5 min。
            注意:(血清)細胞培養(yǎng)基里有血清,血清里過量的血清蛋白與胰酶結合,競爭性抑制,使胰酶無法繼續(xù)消化細胞。
            4.  棄上清,添加新的培養(yǎng)基重懸細胞,向培養(yǎng)瓶/培養(yǎng)皿中添加適當?shù)募毎麘腋∫海⒀a充新鮮(血清)細胞培養(yǎng)基。
            5. 將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
            注意:ATCC建議傳代比例為:1:4至1:8。


            細胞凍存:


            1.當細胞處于對數(shù)生長期時,可進行細胞凍存。
            注意:常見的細胞凍存密度是1-10*10^6 cells/mL。
            2.棄去培養(yǎng)基,用PBS沖洗兩遍細胞層,以消除所有痕量的血清和細胞生長過程中產(chǎn)生的廢料。
            3.加入2.0 ~ 3.0 mL 0.25%(w/v)胰蛋白酶溶液消化細胞,在倒置顯微鏡下觀察細胞直到細胞層分散。
            4.加入適量的(血清)細胞培養(yǎng)基終止消化,槍頭反復吹打混勻后將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管,1000 rpm 5 min。
            5.棄上清,依次加入700 μL培養(yǎng)基,200 μL胎牛血清重懸細胞,最后添加 10% DMSO 后梯度降溫凍存。

            注意:DMSO加到細胞里會迅速放熱,對細胞活力造成損傷,因此可以選擇在最后一步添加,加完迅速轉(zhuǎn)移至低溫。

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            深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術實力、先進的經(jīng)營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業(yè)。總部設在廣東,服務面向全國。安培生物集進口試劑、實驗室耗材銷售、技術服務與合約開發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司,旨在為生命科學的發(fā)展提供較好的產(chǎn)品與服務。本公司建立了涵蓋分子生物學、細胞生物學、免疫學、信號傳導和神經(jīng)科學等領域的產(chǎn)品供應線,在各個領域內(nèi)向用戶提供較高的水平和質(zhì)量穩(wěn)定的產(chǎn)品,安培生物致力于為廣大的科研機構、高等院校等客戶提供各種產(chǎn)品、技術支持與服務。


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