均采用相同的3L生物反應(yīng)器配置：補料、灌流和濃縮補料（CFB）。在所有三種工藝模式中都使用了相同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補料（feed-a和feed-b）。

補料批培養(yǎng)

補料批培養(yǎng)數(shù)據(jù)

補料批方式接種密度為0.5或2×10⁶個/mL。在2×10⁶個細(xì)胞/mL的條件下使指數(shù)生長期縮短2天，第8天密度達(dá)到峰值，而不是在0.5×10⁶細(xì)胞/mL的接種密度條件下第10天。兩種條件下的峰值細(xì)胞密度均在20.2-26.2×10⁶cells/mL范圍內(nèi)。0.5×10⁶個細(xì)胞/mL接種密度條件下，最終存活率為92.5±0.9%，2×10⁶個細(xì)胞/mL接種密度條件下，最終存活率為82.4±4.8%。在早期指數(shù)階段產(chǎn)生有限的抗體。兩種條件下，從指數(shù)期到穩(wěn)定期的后期，產(chǎn)品滴度均以每日0.55-0.63g/L的速率增加，表明兩種條件下的生產(chǎn)速率具有可比性。第14天滴度為5.4±0.1g/L（qP為29.4±2.2pg/cell/day）和6.8±0.2g/L (qP為32.0±2.3pg/cell/day)

生物反應(yīng)器容量產(chǎn)率計算為最終生物反應(yīng)器滴度除以培養(yǎng)時間。2×10⁶細(xì)胞/mL接種密度條件下的體積產(chǎn)率（VPR）高于0.5×10⁶細(xì)胞/mL接種密度條件下的（0.49±0.01g/L/d vs.0.39±0.01g/L/d)，主要是因為它縮短了初始生長階段的時間，延長了生產(chǎn)階段。高接種密度條件下，補料量以葡萄糖水平為基礎(chǔ)，與細(xì)胞密度有關(guān)，因此補料量較高。0.5×10⁶個細(xì)胞/mL接種密度條件下，平均補料量為48%（占生物反應(yīng)器初始體積的百分比），2×10⁶個細(xì)胞/mL接種密度條件下，平均補料量為52%。這可能是在2×10⁶個細(xì)胞/mL接種密度條件下qP略高的原因。

灌流培養(yǎng)

灌流培養(yǎng)數(shù)據(jù)

整個灌流培養(yǎng)過程中保持>85%的高活力。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基條件下，平均細(xì)胞密度維持在44.0±4.1×10⁶個細(xì)胞/mL，從第8天到第32天的日生產(chǎn)力為0.70±0.04g/L/天。在灌流培養(yǎng)中，由于產(chǎn)品直接從灌流側(cè)收獲，因此生物反應(yīng)器的體積生產(chǎn)力計算為灌流滴度×灌流率。到灌流培養(yǎng)結(jié)束時，每日產(chǎn)物收獲率（灌流滴度/生物反應(yīng)器滴度）仍在80%。

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基+補料條件下，隨著細(xì)胞密度的增加，逐漸加入feed-a作為交換培養(yǎng)基的一部分，同時總交換培養(yǎng)基保持1vvd。增加總培養(yǎng)基交換中feed-a的含量，直到第12天達(dá)到總培養(yǎng)基交換的10%，并在剩余的培養(yǎng)時間內(nèi)保持該水平。隨著補料添加量的增加，平均細(xì)胞密度增加到73.9±5.4×10⁶個細(xì)胞/mL，每日生物反應(yīng)器體積生產(chǎn)力增加到2.29±0.28g/L/day。與僅在基礎(chǔ)培養(yǎng)基條件下相比，增加培養(yǎng)基可提高穩(wěn)定細(xì)胞密度和滴度。

總體而言，細(xì)胞特異性生產(chǎn)力從16.0±1.2pg/cell/day增加到30.1±2.3pg/cell/day。結(jié)果表明，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基+補料條件下，生物反應(yīng)器生產(chǎn)率提高了230%。

濃縮補料批（CFB）

濃縮補料培養(yǎng)數(shù)據(jù)

與灌流過程類似，對僅基礎(chǔ)培養(yǎng)基條件和基礎(chǔ)+補料條件進(jìn)行評估。添加額外的補料可提高細(xì)胞培養(yǎng)性能和體積生產(chǎn)力。僅在基礎(chǔ)培養(yǎng)基條件下，峰值細(xì)胞密度達(dá)到72.0±9.6×10⁶個細(xì)胞/mL，第18天的上清滴度為12.2±0.6g/L。對于基礎(chǔ)培養(yǎng)基+補料條件，在培養(yǎng)基交換中評估兩種不同的補料量：條件1使用6%的feed-a和2%的feed-b，條件2使用8%的feed-a和8%的feed-b。條件1產(chǎn)生的峰值細(xì)胞密度為117.4×10⁶個細(xì)胞/mL，第18天的上清滴度為21.4g/L。條件2的峰值細(xì)胞密度為83.4×10⁶個/mL，第18天上清滴度為36.7g/L。在條件2中，當(dāng)feed-a和feed-b的添加量增加時，細(xì)胞比生產(chǎn)力顯著提高到45.1pg/cell/day。獲得的qP與高生產(chǎn)率補料批工藝中報告的水平相似。雖然基礎(chǔ)培養(yǎng)基+補料條件下的存活率下降速度快于單獨純基礎(chǔ)培養(yǎng)基條件，但最終存活率仍維持50%~70%。在相同的培養(yǎng)條件下（例如，僅基礎(chǔ)培養(yǎng)基條件），基于ATF的CFB工藝（50kD）可以產(chǎn)生比灌流（0.2µm）更高的活細(xì)胞密度。

比較了不同工藝模式下的生物反應(yīng)器生產(chǎn)率，包括補料、灌流和CFB工藝。與灌流培養(yǎng)（灌流培養(yǎng)為2.29g/L/d，CFB培養(yǎng)為1.19- 2.04 g/L/d）相比，補料培養(yǎng)具有較低的生物反應(yīng)器生產(chǎn)率（0.39- 0.49g/L/d），因為維持的細(xì)胞密度要低得多。灌流的顯著優(yōu)勢是能夠達(dá)到并保持非常高的細(xì)胞密度，以形成產(chǎn)物，這可以抵消在基礎(chǔ)條件下相對較低的qP。灌流的一個缺點是涉及高培養(yǎng)基成本，因為需要連續(xù)的培養(yǎng)基交換來維持所需的高活細(xì)胞密度。高產(chǎn)量灌流培養(yǎng)的培養(yǎng)基成本（2.29±0.28g/L/d）實際上可以低于補料工藝（第14天滴度為6.8±0.2g/L）。這部分是由于灌流時使用的低細(xì)胞特異性灌流率（14±1pL/細(xì)胞/天）在18天內(nèi)達(dá)到36.7g/L的上清滴度。CFB工藝的培養(yǎng)基成本也是最高的。這在很大程度上是由于CFB培養(yǎng)沒有灌流培養(yǎng)那么長，而且培養(yǎng)時間的很大一部分用于細(xì)胞生長而不是產(chǎn)物形成。