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皖儀科技液相色譜

測(cè)定醬油中黃曲霉毒素·柱后碘試劑衍生專(zhuān)機(jī)系統(tǒng)

繼前期文章《應(yīng)用案例 | 皖儀科技液相色譜測(cè)定黃曲霉毒素》（點(diǎn)擊藍(lán)色標(biāo)題閱讀原文）采用了光化學(xué)衍生器檢測(cè)了中藥材中黃曲霉毒素中B族和G族化合物。本篇文章參考了《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中黃曲霉毒素B族和G族的測(cè)定》GB 5009.22-2016第三法高效液相色譜-柱后碘試劑衍生方法條件，采用皖儀科技高效液相色譜儀LC3200系列配置熒光檢測(cè)器、柱后衍生系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器配置

       皖儀科技高效液相色譜儀LC3200系列

1.2 測(cè)試條件

液相色譜條件流動(dòng)相：A相，水；B相，乙腈-甲醇（50+50）；

等梯度洗脫條件：A，61%；B：39%；

色譜柱：C18 5μm, 4.6×250mm；

柱溫：40℃；

流速：1.0 mL/min；

進(jìn)樣量：50μL；

柱后衍生系統(tǒng)衍生溶液：0.05%碘溶液；

衍生溶液流速：0.2mL/min；

衍生反應(yīng)管溫度：70℃；激光波長(zhǎng)：360nm；發(fā)射波長(zhǎng)：440nm。

1.3 試劑及實(shí)驗(yàn)材料

甲醇（CH3OH）：色譜純；

乙腈（CH3CN）：色譜純；

氯化鈉（NaCl）；

磷酸氫二鈉（Na2HPO4）；

磷酸二氫鉀（KH2PO4）；

氯化鉀（KCl）；

鹽酸（HCl）；

吐溫-20（C58H114O26)；

碘衍生使用試劑：碘（I2）；

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（AFT B1和AFT G1：1μg/mL，AFT B2和AFT G2：0.3μg/mL）；

免疫親和柱；

一次性注射器；

微孔濾膜（0.22μm、0.45μm）；

渦旋混合器；

超聲波清洗機(jī)；

離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥6000 r/min；

氮吹儀。

1.4 溶液配制

n  1.4.1乙腈-甲醇溶液（50＋50）

取500mL乙腈加入500mL甲醇。

n  1.4.2磷酸鹽緩沖溶液（PBS）

稱(chēng)取8.00g氯化鈉、2.92g十二水磷酸氫二鈉、0.20g磷酸二氫鉀、0.20g氯化鉀，用900mL水溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.4，用水定容至1000mL。

n  1.4.3 1%吐溫-20的PBS

取10mL 吐溫-20,用PBS定容至1000mL。

n  1.4.4 0.05%碘溶液

稱(chēng)取0.1g碘，用20mL甲醇溶解，加水定容至200mL，用0.45μm的濾膜過(guò)濾，現(xiàn)配現(xiàn)用。

n  1.4.5混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（AFT B1和AFT G1：100ng/mL，AFT B2和AFT G2：30ng/mL）

準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（AFT B1和AFT G1：1μg/mL，AFT B2和AFT G2：0.3μg/mL）1mL，用乙腈稀釋并定容至10mL。密封后避光-20℃下保存，三個(gè)月內(nèi)有效。

n  1.4.6標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液

分別準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液10μL、50μL、200μL、500μL、1000μL、2000μL、4000μL至10mL容量瓶中，用初始流動(dòng)相定容至刻度（含AFT B1和AFT G1濃度為0.1ng/mL、0.5ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、40.0ng/mL，AFT B2和AFT G2濃度為0.03ng/mL、0.15ng/mL、0.6ng/mL、1.5ng/mL、3.0ng/mL、6.0ng/mL、12ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

       圖1 黃曲霉毒素G2標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及相關(guān)系數(shù) 

       圖2 黃曲霉毒素G1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及相關(guān)系數(shù)

      圖3 黃曲霉毒素B2標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及相關(guān)系數(shù)

                圖4 黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及相關(guān)系數(shù)

說(shuō)明：黃曲霉素素G2、G1、B2與B1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性范圍較好，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)＞0.9999，滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)分析需求。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品

      圖5 黃曲霉毒素G2 G1 B2 B1標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

      表2黃曲霉毒素G2 G1 B2 B1標(biāo)準(zhǔn)品色譜參數(shù)表

說(shuō)明：由上述混標(biāo)譜圖可見(jiàn)，標(biāo)準(zhǔn)品分離較好，分離度在2.0以上，滿(mǎn)足分離要求。

2.3 重復(fù)性

    圖6 黃曲霉毒素G2,G1,B2,B1標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)性實(shí)驗(yàn)色譜圖

            表3黃曲霉毒素G2色譜參數(shù)

            表4黃曲霉毒素G1色譜參數(shù)

            表5黃曲霉毒素B2色譜參數(shù)

                               表6黃曲霉毒素B1色譜參數(shù)

說(shuō)明：黃曲霉毒素G2保留時(shí)間RSD值為0.116%，峰面積RSD值為0.620%；黃曲霉毒素G1保留時(shí)間RSD值為0.104%，峰面積RSD值為0.575%；黃曲霉毒素B2保留時(shí)間RSD值為0.100%，峰面積RSD值為0.259%；黃曲霉毒素B1保留時(shí)間RSD值為0.114%，峰面積RSD值為0.346%，重復(fù)性較好。

2.4 檢出限

       圖7黃曲霉毒素G2,G1,B2,B1標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

         表7黃曲霉毒素G2,G1,B2,B1色譜參數(shù)

          表8黃曲霉毒素G2,G1,B2,B1檢測(cè)限

2.5 樣品測(cè)試

n  2.5.1樣品提取

稱(chēng)取5.0039g醬油于50mL離心管中，加入甲醇定容至25mL,渦旋混勻，置于超聲波中振蕩20min，在6000 r/min下離心10 min,取上清液備用。

n  2.5.2樣品凈化

2.5.2.1上樣液的準(zhǔn)備準(zhǔn)確移取4mL上述上清液，加入46mL 1% 吐溫-20的PBS，混勻。2.5.2.2免疫親和柱的準(zhǔn)備將低溫下保存的免疫親和柱恢復(fù)至室溫。

n  2.5.2.3試樣的凈化

免疫親和柱內(nèi)的液體放棄后，將上述樣液移至50mL注射筒中，調(diào)節(jié)下滴速度，控制樣液以1mL/min～3mL/min的速度穩(wěn)定下滴。待樣液滴完后，往注射筒內(nèi)加入2×10mL水，以穩(wěn)定流速淋洗免疫親和柱。待水滴完后，在親和柱下部放置10mL刻度試管，取下50mL的注射器筒，2×1mL甲醇洗脫親和柱，控制1mL/min～3mL/min的速度下滴，收集全部洗脫液至試管中。在50℃下用氮?dú)饩従弻⑾疵撘捍抵两?，用初始流?dòng)相定容至1.0mL，渦旋30s溶解殘留物，0.22μm濾膜過(guò)濾，收集濾液于進(jìn)樣瓶中進(jìn)樣。進(jìn)樣量取50μL上樣分析，檢測(cè)譜圖如下：

                                  圖8醬油樣品色譜圖

說(shuō)明：從檢測(cè)結(jié)果可知，醬油樣品中未檢出黃曲霉毒素G2 G1 B2 B1，結(jié)果正常。

3 結(jié)論

本次采用皖儀科技高效液相色譜儀LC3200系列配置熒光檢測(cè)器、柱后衍生系統(tǒng)，依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中黃曲霉毒素B族和G族的測(cè)定》GB 5009.22-2016第三法高效液相色譜-柱后衍生法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃曲霉毒素G2 G1 B2 B1的線(xiàn)性良好，R值均在0.999以上，各黃曲霉毒素峰型較好，分離度均在2.0以上，分離效果好。黃曲霉毒素G2 G1 B2 B1的定性RSD（%）和定量RSD（%）均小于1%，符合標(biāo)準(zhǔn)。說(shuō)明了該方法配備皖儀科技LC3200系列儀器檢測(cè)黃曲霉毒素的可行性，完全滿(mǎn)足黃曲霉毒素的檢測(cè)要求。