產(chǎn)品及特點：
諾如病毒（Norwalk Virus）是單股正鏈 RNA 病毒，屬于人類杯狀病毒屬，是一種引起非細菌性急性腸胃炎的病毒，如諾病毒感染性強，以腸道傳播為主，通過口-糞傳播，以污染的水源、食物、貝類、物品、空氣作為主要傳播載體。諾如病毒可分為 G I-G 五個基因群，其中引起人類感染的主要是 G1 和 G2 群。因此快速靈敏診斷具有重要意義。為此本公司開發(fā)了本產(chǎn)品，采用RT-PCR 技術檢測疑似感染動物血清或組織中的諾如病毒 G1 型。它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品RNA模板。
2. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
3. 產(chǎn)品精心優(yōu)化且特異性高，引物是根據(jù)諾如病毒 G1 型RNA高度保守區(qū)設計，不會跟除此之外的其它病毒RNA發(fā)生交叉反應。
4. RT-PCR mix 中含上樣染料，擴增反應后可以直接上樣電泳。
5. 本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的PCR反應。
6. 本產(chǎn)品只能用于定性實驗，不能用于定量。
7. 本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分：
成 份 |
A |
B |
C |
D |
E |
使用手冊 |
注：為避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供專一的核酸片段作為陽性對照。
運輸及保存：
低溫運輸，-20℃保存，保存期限為12個月。
自備試劑：樣品RNA
使用方法：
一、樣品DNA的制備
1. 如果有N個樣品，必須設置N+2個提取反應，多出的兩個中一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?span>10μL諾如病毒 G1 型PCR陽性對照（1×10E6拷貝/μL，本試劑盒提供）再加上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ铡?/span>
2. 用自選方法純化上述N+2個樣品的DNA。本試劑盒跟市場上大多數(shù)細菌DNA提取試劑盒兼容。
二、設置PCR反應（20μL體系）
3. 標記N+4個PCR管，其中N+2個用于上步得到的DNA樣品，額外增加的兩個管一個用于PCR陽性對照，另一個用于PCR陰性對照。按照下表在各PCR管中加入下列成分：
成分/每管 | 樣品管 N+2個 | PCR陰性對照 | PCR陽性對照 |
A | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
D | 2 μL | 2 μL | 2 μL |
制備的N+2個DNA樣品 | 7 μL | - | - |
C | - | 7 μL | - |
E | - | - | 7 μL |
B | 1 μL | 1 μL | 1 μL |
4. 上機進行PCR，PCR反應參數(shù)為:
過程 | 溫度 | 時間 |
逆轉錄 | 50℃ | 20 min |
預變性 | 95℃ | 10 min |
PCR反應 （45個循環(huán)） | 95℃ | 30 sec |
55℃ | 60 sec | |
72℃ | 60 sec | |
延伸 | 72℃ | 7 min |
三、電泳分析
5. 取5-10uL擴增產(chǎn)物進行常規(guī)瓊脂糖電泳，檢測擴增效果，由于擴增產(chǎn)物較短，建議用1.5%-2.0%的瓊脂糖凝膠。
6. 陽性樣品預期得到的擴增產(chǎn)物長度為220bp左右。如果兩個陰性對照（樣品制備陰性對照或PCR陰性對照）有此擴增產(chǎn)物，說明環(huán)境污染，則整個實驗無效，不需要分析實驗結果。
7. 如果所有樣品和PCR陽性對照均無此擴增產(chǎn)物，則說明有系統(tǒng)性的問題（試劑、設備、程序、操作等），需要重復并排查原因。
8. 如果沒有上述兩種情況，則實驗有效，可以分析樣品的擴增結果。N+2個樣品中有擴增產(chǎn)物的判定為陽性，無則判定為陰性。
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