【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：牛細小病毒(BPV)核酸擴增檢測試劑盒(熒光-PCR法)
Name ：Bovine Parvovirus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】48T/盒
【預期用途】
牛細小病毒病是由牛細小病毒感染引起的一種接觸性傳染病。該病主要臨床特征是母牛生殖機能障礙和犢牛呼吸道、消化道疾病。該病毒主要經(jīng)口和空氣等途徑傳遞。
本試劑盒適用于檢測腹瀉糞便、腸系膜淋巴結、肝臟、腎、肺、肝、腦、睪丸、胎盤和淋巴結、全血等樣本中的牛細小病毒，用于牛細小病毒感染的輔助診斷。
【檢驗原理】
本試劑盒根據(jù)牛細小病毒基因組設計特異性引物和探針[1-2]，用熒光PCR技術對牛細小病毒的核酸進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。
【試劑組成】
名 稱 | 規(guī) 格 |
核酸提取液 | 1.5mL×2管 |
酶液 | 50μL×1管 |
BPV反應液 | 1.0mL×1管 |
BPV陽性質控品 | 50μL×1管 |
陰性質控品 | 250μL×1管 |
說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數(shù)不超過5次，有效期12個月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf等系列熒光定量PCR檢測儀。
【標本采集】
疑似感染仔牛取腸系膜淋巴結或肝臟；流產(chǎn)或死胎的腎、肺、肝、腦、睪丸和胎盤肺、淋巴結等組織；待檢活牛，用注射器取血5mL
【保存和運輸】
上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過6個月，標本運送應采用2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。
【使用方法】
1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1 樣本前處理
組織、糞便樣品：取樣品約1g，于研磨器中研磨，加入1.5mL生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中；全血樣本：待血凝固后，取血清100μL于滅菌離心管中。1.2 DNA提取
1) 對上述處理好的標本加入50μL核酸提取液，100℃恒溫處理10min，13,000 rpm離心5min，取上清液轉移至新的1.5mL EP管，-20℃保存
2) DNA的提取也可以采用優(yōu)利科（上海）生命科學有限公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒（離心柱提取法），請嚴格按照試劑盒說明書進行操作。
2. 試劑配制（試劑準備區(qū)）
根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設所需要的PCR反應管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照；樣品每滿7份，多配制1份)，每測試反應體系配制如下表：
試劑 | BPV反應液 | 酶液 |
用量（樣本數(shù)為N） | 20μL | 1μL |
3.加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟1提取的DNA、陽性質控品、陰性質控品各取4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4. PCR擴增（核酸擴增區(qū)）
4.1 將待檢測反應管置于熒光定量PCR儀反應槽內(nèi)；
4.2 設置好通道、樣品信息，反應體系設置為25μL；
熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，請勿選擇ROX參比熒光。
4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設置：
步驟 | 循環(huán)數(shù) | 溫度 | 時間 | 收集熒光信號 |
1 | 1 cycle | 95℃ | 10min | 否 |
2 | 40 cycles | 94℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
結果分析判定
5.1 結果分析條件設定
設置Baseline和Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值(一般可在3~15范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop值(一般可在5~20范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。
5.2 結果判斷
陽性：檢測通道Ct值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線；
可疑：檢測通道35<Ct值≤38，建議重復檢測，如果檢測通道仍為35<Ct值≤38，且曲線有明顯的增長曲線，判定為陽性，否則為陰性；
陰性：樣本檢測結果Ct值>38或無Ct值。
6. 質控標準
陰性質控品：Ct>38或無Ct值顯示；
陽性質控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且Ct值≤32；
以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。
7. 檢測方法的局限性
? 樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；
? 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結果；
? 陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導致假陽性結果；
? 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；
? 不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；
? 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結果；
? 本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。
【注意事項】
? 所有操作嚴格按照說明書進行；
? 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化，wan全混勻并短暫離心；
? 反應液應避光保存；
? 反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；
? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；
? 實驗完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；
? 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。
【參考文獻】
[1] 羅濟冠. 牛細小病毒檢測試劑的制備及快速檢測方法的建立[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學, 2012.
[2] 鄭從義, 郭佳, 李勇. CN101565759A 一種檢測牛細小病毒的熒光定量PCR試劑盒及應用. 中華人民共和國專li.
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