半胱氨酰亞砜裂解酶（L-cysteine sulfoxide lyase, CSL）試劑盒說明書
微量法100T/48S
注 意 ：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義：
半胱氨酰亞砜裂解酶（CSL）廣泛存在于百合科蔥屬(如大蒜和洋蔥)，十字花科蕓薹屬
(如卷心菜，菜花，西蘭花)，以及豆科中的合金歡屬中，并通常被稱為蒜氨酸酶(Alliinase)。香菇酸在γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶和半胱氨酸亞砜裂解酶的作用下轉(zhuǎn)化成香菇精，以及產(chǎn)生丙酮酸、乙醛、甲醛和NH3。CSL是內(nèi)源性甲醛生成的關(guān)鍵酶之一，測(cè)定CSL活性對(duì)于研究食品安全具有重要意義。
測(cè)定原理：
CSL催化S-甲基-L-半胱氨酸亞砜反應(yīng)產(chǎn)生丙酮酸，與2,4-er硝/基苯肼反應(yīng)，在堿性條件下顯棕紅色，在510nm下有特征吸收峰。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：
天平、研缽、離心機(jī)、酶標(biāo)儀、96孔板、恒溫水浴鍋、蒸餾水。
試劑組成和配制：
提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：粉劑×1瓶，4℃避光保存，臨用前加入2mL水溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存；
試劑二：粉劑×1瓶，-20℃避光保存，臨用前加入10mL水溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存；
試劑三：液體15mL×1瓶，4℃保存。
試劑四：液體6mL×1瓶，4℃避光保存。
試劑五：液體30mL×1瓶，4℃保存。
樣本處理：
按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿，4℃浸提40min。12000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
測(cè)定操作：
對(duì)照管 | 測(cè)定管 | |
樣品（μL） | 50 | 50 |
試劑一（μL） | 25 | |
蒸餾水（μL） | 25 | |
試劑二（μL） | 25 | 25 |
充分混勻，37℃反應(yīng)20min | ||
試劑三（μL） | 100 | 100 |
試劑四（μL） | 50 | 50 |
充分混勻，室溫反應(yīng)5min | ||
試劑五（μL） | 250 | 250 |
充分混勻，靜置5min，吸取200μL至96孔板，測(cè)定510nm處吸光值，記為A對(duì)照和A測(cè)定，△A=A測(cè)定-A對(duì)照。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。 | ||
計(jì)算公式：
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.7313x + 0.0027，R2 = 0.9993；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度：μmol/mL；y為吸光度△A
1. 按蛋白含量計(jì)算
C-S lyase活性（μmol/min/mg prot）=（△A -0.0027）÷ 0.7313×V樣÷(V樣×Cpr )÷T
=0.068×（△A-0.0027）÷ Cpr
2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算
C-S lyase活性（μmol/min/g 鮮重）=（△A -0.0027）÷ 0.7313×V樣÷(V樣÷V樣總×W )÷T
=0.068×（△A-0.0027）÷ W
V樣，加入樣本上清體積，0.05mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T，反應(yīng)時(shí)間，20min。
注意事項(xiàng)：
1. 若測(cè)定結(jié)果中吸光值超過1，請(qǐng)將樣本稀釋后進(jìn)行測(cè)定，并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。香菇類樣本活性較大，可能需要稀釋80-100倍。
提供商 |
優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司 | 下載次數(shù) |
9次 |
資料大小 |
133.5KB | 資料類型 |
WORD 文檔 |
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