考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法 100T/96S
注 意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義：
樣品可溶性蛋白質(zhì)含量常常用于酶活性計(jì)算。此外，可溶性蛋白質(zhì)含量也用于食品等質(zhì)量分析。
測(cè)定原理：
在酸性溶液中，考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合形成藍(lán)色復(fù)合物；該復(fù)合物在620nm處有最大吸收峰， 其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比。該方法靈敏度高，適合微量蛋白質(zhì)分析。
自備儀器和用品：
離心機(jī)、酶標(biāo)儀、96孔板、移液器和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體11 mL×1瓶，4℃保存。
樣品中可溶性蛋白質(zhì)提?。?/span>
1. 液體樣品：澄清液體樣品可以直接測(cè)定。
2. 組織樣品：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：20的比例（建議稱(chēng)取約0.05 g組織，加入1mL提取液（自備，根據(jù)需要選用酶提取緩沖液或者蒸餾水或者生理鹽水））
冰浴勻漿，8000g，4℃離心10min，取上清，即待測(cè)液。（動(dòng)物樣品常常需要稀釋?zhuān)?/span>
3. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。
測(cè)定操作：
1. 酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min。
2. 在96孔板中加入：
試劑（μL） | 測(cè)定管 | 空白管 |
樣本 | 100 | |
蒸餾水 | 100 | |
試劑一 | 100 | 100 |
混勻后，測(cè)定波長(zhǎng)620 nm吸光值，△A=A測(cè)定-A空白。 | ||
注意：空白管只需要測(cè)定一次。
計(jì)算公式：
標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：y = 7.1265x - 0.0007 R2 = 0.9997 x: 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL)
y: 吸光值差值
1.按液體樣本體積計(jì)算：
Cpr（mg/mL）=(△A+0.0007)÷7.1265
=0.1403×(△A+0.0007)
2.按組織樣本質(zhì)量計(jì)算：
Cpr（mg/g）=(△A+0.0007)÷7.1265×V總÷W
=0.1403×(△A+0.0007)÷W
V總：提取液體積，1 mL; W：樣本質(zhì)量，g。
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